微生物学技术在食品专业综合实验教学中的应用与实践——以“猪源大肠杆菌耐药性调查研究”为例

蒋 晗，李佳瑶，方结红，黄光荣，朱诚

（中国计量大学浙江省海洋食品品质及危害物控制技术重点实验室，浙江杭州 310018）

0 引言

食品质量与安全专业自2002年招生至今，已在117所大学开设，分布在农、工、商、师、医、水及综合等各类高校。而食品质量与安全专业综合实验是本科生在学习了食品学科基础课程、专业基础课程和专业课程，具有了一定理论基础、专业技能和科学思维后，所进行的实践性教学环节，是培养学生实验设计能力、实验操作能力、问题总结能力和交流协调能力的一门侧重点在“质量”与“安全”上的专业综合实验课程，也是食品质量与安全专业本科生的必修课[1]。

食品质量与安全专业综合实验是一门独立成课的专业课程，它打破了传统教学中实验课程作为教学课程的补充与辅助模式，形成了“学习、实践、创新相互促进”的实践教学理念，这在提高教学质量、加强学生专业综合能力和培养创新创业意识上起到了不可替代的作用[2-6]。

以学校食品质量与安全专业综合实验课题“猪源大肠杆菌耐药性调查研究”为例，该课题由大四第一学期食品质量与安全专业本科生完成，由食品微生物技术方向指导教师进行指导。试验采集杭州市农贸市场和超市新鲜猪肉样本，利用选择性培养基和特异性基因uidA分离鉴定大肠杆菌，利用K-B法药敏试验检测其对抗生素的耐药性，并利用PCR法进一步分析耐药大肠杆菌携带耐药基因的情况。这是一个半开放实验，猪肉样品和大肠杆菌筛选是固定内容，而耐药性研究是开放的，可由学生就自己查阅的文献或感兴趣的内容进行深入研究。以下就是其中一组学生经指导教师指导后，形成的试验方法与结果分析案例。

1 试验方法与结果

1.1 方法

1.1.1 样品采集与前处理

样品采集自浙江省某地区的20家农贸市场和20家超市，每家农贸市场或超市各选5个摊位，分别购买生鲜猪肉1份（约100 g），农贸市场和超市样品总计各100份。每份生鲜猪肉独立放置于无菌保鲜袋中，记录采样地点和采样时间后藏于冰盒，迅速低温保存运回实验室。运回实验室后，立即在超净工作台用灭菌剪刀剪取25 g样品，放入无菌袋内，向无菌袋内加入225 mL无菌蛋白胨水，用均质器高速均质2 min，充分混匀，收集上清液约10 mL装入15 mL无菌离心管于4℃下冷藏备用。

1.1.2 大肠杆菌的分离和鉴定

大肠杆菌的分离方法参照GB 4789.38—2012食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数。大肠杆菌的分子鉴定方法骤如下：在NCBI网站下载大肠杆菌特异基因序列 uidA（GenBank ID：S69414），并利用primer premier 5.0软件设计特异性引物：uidAF：5’-GTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGAA-3'； uidAR：5'-GGGATAGTCTGCCAGTTCAGTTCGT-3'。引物由上海生工合成。PCR反应体系（25.0μL）：上、下游引物各 1.0μL（10μmol/L），模板 DNA 2.0μL（250ng/μL），Premix Taq12.5μL，加ddH2O至25.0μL。PCR反应条件：94℃预变性1 min，98℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃延伸10 min。取PCR反应产物5μL，于1.2% 琼脂糖凝胶中电泳，检测扩增结果。

1.1.3 药敏试验

根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 推荐的 K-B纸片扩散法进行药敏实验，筛选对氯霉素类的氯霉素、氨基糖苷类的庆大霉素、磺胺类的复方新诺明、四环素类的四环素、喹诺酮类的环丙沙星、β-内酰胺类的头孢西丁等抗生素具有耐药性的大肠杆菌。根据药敏试验结果，测量抑菌圈直径大小，比对NCCLS标准，分别判断该菌为耐药（R）、中介（I）或敏感（S）。

1.1.4 四环素类耐药基因tetA的检测

利用试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA，用primer premier 5.0软件设计tetA特异性引物：tetAF：5'-GGCACCGAATGCGTAGAT-3'；tetAR：5'-AAGCG AGCGGGTTGAGAG-3'。引物由上海生工合成。PCR反应体系 （25.0μL）：上、下游引物各 1.0μL（10 μmol/L）， 模 板 DNA 2.0 μL（250 ng/μL），Premix Taq 12.5μL，加ddH2O至 25.0μL。PCR反应条件：94℃预变性1 min，98℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃延伸5 min。取PCR反应产物5μL，于1.2%琼脂糖凝胶中电泳，检测扩增结果。

1.2 结果与分析

1.2.1 大肠杆菌的分离和鉴定

通过伊红美蓝培养基从100份农贸市场生鲜猪肉样品中分离到大肠杆菌100株（每份样品计分离株1株），未从超市生鲜猪肉样品中分离到大肠杆菌。选用大肠杆菌特异性基因uidA为扩增对象，对疑似菌株进行PCR鉴定，标准菌株作为阳性对照，ddH2O作阴性对照，大肠杆菌特异性条带为424 bp。经PCR鉴定，100株农贸市场生鲜猪肉源大肠杆菌疑似菌株均出现特异性条带，阳性检出率达到100%。

大肠杆菌分离鉴定见图1。

图1 大肠杆菌分离鉴定

1.2.2 大肠杆菌耐药情况分析

猪源大肠杆菌分离株药敏分析见表1。

由表1可知，①农贸市场样品中大肠杆菌对于庆大霉素、氯霉素、复方新诺明、四环素、头孢西丁、环丙沙星6种抗生素耐药率分别为5%，52%，14%，100%，5%，19%；②分析结果表明，农贸市场来源的大肠杆菌对四环素的耐药率显著高于对头孢西丁、环丙沙星、氯霉素、复方新诺明和庆大霉素等5种抗生素的耐药率（p＜0.05）；③多重耐药率达到59%，表明猪源大肠杆菌的多重耐药性已经成为普遍现象。

表1 猪源大肠杆菌分离株药敏分析

大肠杆菌K-B药敏试验示意图见图2。

图2 大肠杆菌K-B药敏试验示意图

1.2.3 四环素类耐药基因型tetA检测结果

利用PCR方法对大肠杆菌四环素类耐药基因tetA的携带情况进行分析，结果显示大肠杆菌中tetA基因的检出率达到65.00%（65/100），表明对四环素类抗生素产生耐药性的大肠杆菌中大多富含tetA基因。

四环素类耐药基因tetA凝胶电泳图见图3。

图3 四环素类耐药基因tetA凝胶电泳图

2 试验教学效果分析

通过综合实验的学习，学生能够掌握微生物检验的国标方法，微生物分子生物学基本设计与操作、美国临床和实验室标准协会推荐的K-B纸片扩散法药敏试验等一系列重要的微生物学技术。对于大部分基础性实验采用计划安排的方式，在规定时间由全班学生统一完成，如此次实验的大肠杆菌分离鉴定工作。对于少部分综合设计性实验采用课堂教学和小组预约结合的方式，如猪肉采样和前处理工作，由指导教师课堂教学采样及前处理方式，再由每5～6位学生具体负责一个区域的采样，并立即送回实验室进行前处理工作，指导教师或研究生现场指导。对于研究创新性实验采用学生个人预约的方式，如此次实验的耐药数据分析处理工作，可由每位学生根据自己感兴趣的角度对大量数据进行分析，并撰写论文，期间可预约指导教师进行探讨。通过多种渠道投入，逐步形成理论教学与实践教学相互协调的实践新体系。

加强师生有效互动，在指导教师的帮助下，食品质量与安全专业本科生有更多机会锻炼科学思维，提升科研能力。在综合实验学习过程中，以学生为主体，指导教师采用讨论式教学和启发式教学，起到引领方向和答疑解惑的作用，既有大课堂的理论教学，又有分组及点对点的讨论，以多种形式启发引导学生自主学习，独立分析、思考、和解决问题。

最后，在雄厚的科研实力支撑下，将科研中的先进实验方法与内容带进实践教学中，以实验内容改革引导实验技术开发，新型的实验技术成果又反过来推动实验内容的不断完善。同时，安排高层次理论课教师担当实践教学、实验项目开发和实验室管理，既加强了理论教学、科学研究与实践教学的结合，提高了实践教学水平，又带动和帮助实验教师提高教学与科研水平，提高实践教学质量。