整合高分辨熔解曲线和Sanger测序的MTHFR基因C677T多态性检测新方法及其应用

王 榕，白慧丽，程 伟，张玉洪△

(重庆医科大学附属第一医院：1.检验科；2.临床分子医学检测中心 400016)

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是人体叶酸代谢的关键酶，C677T是MTHFR基因最常见的多态性，会导致酶活性差异，影响机体叶酸代谢[1]。与野生型比较，杂合突变型与纯合突变型表达的酶活性分别下降30%和70%[2]。C677T多态性与高同型半胱氨酸血症[3]、高血压[4]、心脑血管意外[5]、习惯性流产[6]、胎儿出生缺陷如神经管缺陷[7]、先天性心脏病[8]等明显相关。我国《高血压合理用药指南》(第二版)[9]和《围受孕期增补叶酸预防神经管缺陷指南(2017)》[10]均明确指出应基于MTHFR基因C677T检测结果进行个体化干预，合理补充叶酸，防止高血压并发症和出生缺陷。

目前，针对MTHFR基因C677T检测，临床应用较多的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析过程繁琐，周期较长，易造成污染；Sanger测序是基因检测金标准，但成本高昂，通量不足，不适于临床大规模分析。高分辨熔解曲线(high resolution melting curve，HRM)分析技术是一种基于高分辨检测不同基因型扩增产物熔解温度(Tm)差异的基因多态性分析新方法[11]，该方法具有快速简便、经济和高通量的优点，适用于临床批量检测。然而，传统的HRM分析技术在临床实际应用过程中仍需突破以下固有缺陷：对部分野生型及纯合突变型辨识能力不足，且对各标本扩增效率的一致性要求严苛。因此，本研究建立了一种基于整合优化的HRM和Sanger测序的分子诊断新方法，并探索其MTHFR基因C677T基因多态性检测临床应用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 收集2016年6月至2017年10月本院体检中心1 030份乙二胺四乙酸二钾(EDTA-2K)抗凝外周血标本；CC、CT和TT基因型DNA各10份(自备，均经Sanger测序确认)。主要仪器与试剂：实时荧光定量PCR仪、LightCycler 480 High Resolution Melting Master(瑞士罗氏公司)；3500Dx测序仪(美国赛默飞公司)。

1.2方法

1.2.1DNA提取 提取基因组DNA，测定其纯度和浓度并将浓度调至4 ng/μL。

1.2.2引物设计与验证 用Primer Premier5.0软件设计针对MTHFR基因C677T多态性特异性引物，并引入正向(F)、反向(R)M13接头。MTHFR-F：5′-M13F-GAA GCA CTT GAA GGA GAA-3′;MTHFR-R：5′-M13R-TCA CAA AGC GGA AGA AGT-3′。M13F：5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′;M13R：5′-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3′。通过PCR产物电泳及Sanger测序验证引物特异性。

1.2.3优化HRM分析技术 反应体系：4 ng/μL标本DNA 5.00 μL，4 μmol/L正、反向引物各0.50 μL，25 mmol/L MgCl22.00 μL，PCR MIX 10.00 μL，在此基础上加入4 ng/μL CC基因型DNA 0.83 μL(相当于DNA总量1/7)，余用ddH2O补足至20.00 μL。反应程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，65 ℃至50 ℃退火10 s，72 ℃ 10 s，45个循环；95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s，收集65 ℃至95 ℃荧光信号(升温速度0.02 ℃/s)；40 ℃ 30 s。

1.2.4Sanger测序直接检测HRM产物 以M13R为测序引物直对1.2.3中“灰区”标本HRM产物进行Sanger测序。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0 软件进行数据分析，计量资料以频数或百分率表示。

2 结 果

2.1引物特异性验证 PCR产物电泳结果为预期条带，经Sanger测序验证为目标序列，见图1。

M:DL 2000 DNA Marker;1～6:标本PCR产物

2.2优化的HRM反应体系 传统HRM方法无法区分野生型和纯合突变型DNA。本研究加入相当于DNA总量1/7的野生型DNA优化后能够显著区分3种基因型，且结果与Sanger测序结果一致，见图2。

图2 加入1/7野生型DNA前后的熔解曲线

2.3MTHFR基因C677T多态性检测结果 基于优化的HRM联合Sanger测序成功检测1 030份未知标本：其中1 024份(99.42%)由优化的HRM有效分型；余6份(0.58%)经HRM无法分型，其HRM产物经Sanger测序为2份野生型、3份杂合突变型和1份纯合突变型，见图3。本研究中1 030份DNA的MTHFR基因C677T野生(CC)基因型为403份(39.13%)，杂合突变(CT)基因型为496份(48.16%)，纯合突变(TT)基因型为131份(12.71%)；等位基因(C)的频率为1 302份(63.20%)，等位基因(T)的频率为758份(36.80%)。

3 讨 论

HRM是一种基于单核苷酸Tm值差异的高灵敏基因分析技术。它通过实时监测DNA双链沟槽中饱和荧光染料信号值的变化，从而将单个碱基差异通过不同形态的熔解曲线直观地展示出来。但是，在使用HRM技术检测单核苷酸多态性时往往会出现部分纯合突变型和野生型标本无法辨识的问题[12-13]。本研究在实验初始阶段使用传统HRM方法时结果亦是如此。随后，基于PALAIS等[14]研究，通过加入1/7野生型DNA并在扩增结束后变性杂交(95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min)使纯合突变型标本产生部分异源杂化双链DNA，造成其Tm值下降，从而准确区分于野生型标本。

笔者使用上述优化HRM反应体系能够有效甄别绝大多数(99.42%)标本MTHFR基因C677T多态性，但仍有6份(0.58%)标本使用优化HRM无法辨别基因型。由于HRM对于各标本扩增效率的一致性要求严苛，笔者推测这6份标本可能是因其DNA自身存在抑制剂等原因造成扩增效率不足，导致上述优化方案也无法检测。因此，笔者通过Sanger测序检测这6份“灰区”标本的MTHFR基因C677T多态性。如图3C所示，本研究优化时加入1/7野生型DNA造成测序时纯合突变型红色T峰下有低小的蓝色C峰，随后笔者利用Chromas分析软件将其选作“背景干扰”进行校正后碱基读取结果并未改变，说明本文所构建的优化方案对下游测序分析无干扰。本研究设计的引物专门修饰了M13接头，可直接对6份标本HRM产物进行Sanger测序验证，无需重新扩增标本，且得到了准确可靠的测序结果。

如前所述，MTHFR基因C677T多态性与许多疾病显著相关。本研究中TT基因型频率高达12.71%，与其他已报道数据大体一致[15]。随着MTHFR基因C677T检测被逐渐纳入相关诊疗指南，建立适用于临床大规模筛查的基因检测新方法十分必要。本研究针对MTHFR基因C677T多态性，建立了一种基于有机整合优化的HRM和Sanger测序的新方法，在保留传统HRM法无需特异性探针、闭管操作无污染、灵敏度高、特异度高、经济简便、快速和高通量等优势的基础上，进一步提高了传统HRM的基因分型能力和准确性。因此，本课题组所设计的整合优化的HRM和Sanger测序的分子诊断新方法能够有机结合HRM和Sanger测序的优势，适用于大规模临床标本检测。此外，本研究所构建的新方法不仅可用于MTHFR基因C677T多态性的临床批量检测，也可推广应用于其他基因多态性检测，具有重要的临床应用推广价值。