kisspeptin/kiss1r系统在复发性流产患者中的表达及意义*

张冬梅,孙凤英，蔺香云

(滨州医学院附属医院：1.生殖医学科；2.麻醉科；3.妇产科，山东滨州 256603)

复发性流产发病率占妊娠总数的1%～3%，研究显示遗传、内分泌异常、感染、自身抗体、凝血机制等均与其发生有关，但仍有50%患者病因不明确[1]。kisspeptin受体kiss1r 属于肿瘤转移、侵袭因子，在乳腺癌、黑色素瘤中研究显示其表达与肿瘤细胞的转移能力呈负相关[2-3]。近期研究显示kiss1r 与胎盘滋养细胞浸润异常及胎盘功能不良有关，在不良妊娠者血清中呈低表达[4]。基于以上研究推测其还可能与复发性流产的发生有关。本研究通过检测复发性流产病例绒毛组织中kisspeptin、kiss1r的表达，并在体外进行验证，探究复发性流产可能的病理机制，为临床治疗提供一定的参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2015年4月至2017年5月在本院进行治疗的复发性流产患者46例进行研究(病例组)，年龄20～35岁，平均(27.54±4.18)岁，另选取20例人工流产患者作为对照组，年龄22～36岁，平均(28.13±3.66)岁，所纳入对象均月经规律、知情同意，无慢性病史、生殖道畸形、染色体异常、感染、妊娠内分泌相关疾病，未近期服用激素药物等。

1.2方法

1.2.1标本来源 患者入院时采集静脉血3 mL，保存于-20 ℃以备后续使用。患者经刮宫术取出的妊娠组织在生理盐水中漂洗后，分离新鲜绒毛组织，一部分置于-80 ℃中保存，一部分置于4%多聚甲醛溶液中。JAR、JEG-3绒癌细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所，置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基，放置在37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。

1.2.2实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法 采用RNA试剂盒提取绒毛组织RNA，并反转录为cDNA。RT-qPCR反应体系为20.0 μL：SYBR Premix 10.0 μL，cDNA 1.0 μL，H2O 8.0 μL，上下游引物各0.5 μL。反应程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共循环40 次。以GADPH作为内参计算kisspeptin、kiss1r mRNA相对表达水平。

1.2.3Western blot法 收集细胞培养液，离心后添加裂解液反应30 min，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，参考文献[5]进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳、转膜反应，结束后置于凝胶成像仪中观察蛋白表达情况。

1.2.4免疫组织化学法 常规制备绒毛组织切片(4 μm)，用二甲苯脱蜡，参考文献[6]进行免疫组织化学染色，置于显微镜下进行观察。每张切片挑选10个视野，计算阳性染色细胞数比例。

1.2.5血清中性激素相关指标检测 采用酶联免疫法检测血清中促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、促黄体生成激素 (leuteinizing hormone，LH)、雌二醇(estriol，E2)、催乳素(prolactin， PRL)及孕酮(progesterone,P)水平。

1.2.6细胞转染 构建重组质粒pcDNA3.1-kiss1r，取对数期细胞，细胞饥饿培养1 h，参照试剂盒分别转染JAR、JEG-3细胞，分为空白对照组、阴性转染组、kiss1r转染组，转染后培养48 h，随后收集细胞上清液，进行后续测定。

1.2.7细胞增殖测定 收集转染后细胞，添加至96孔培养板，调整细胞密度为5×104/孔，分别继续培养12、24、48、72 h，弃上清液，向孔内加入20 μL CCK-8溶液，继续培养4 h后，在酶标仪中检测460 nm处吸光度值。

1.2.8平板细胞克隆形成实验检测克隆形成 将转染后培养48 h的细胞接种在96孔板中孵育24 h后，磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗细胞3次，加入4%甲醛溶液(甲硫醇∶冰乙酸=7∶1)固定15 min，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养14 d。用固定剂固定15 min后，用含0.1% Gimsa溶液染色30 min后，干燥后拍照计数克隆形成个数。

1.2.9Transwell实验检测细胞迁移能力 转染后细胞饥饿培养24 h后，在Transwell上室加入300 μL细胞悬液，下室加入500 μL含胎牛血清培养液，培养24 h后，保留室内下层细胞，清理未迁移细胞，加入结晶紫染液染色15 min，在显微镜下进行计数。

1.2.10Transwell实验检测细胞侵袭能力 用50 mg/L Matrigel 1∶8稀释液60～80 μL包被Transwell小室聚碳酸酯膜的上室面，置于37 ℃使其风干呈凝胶状态。细胞转染正常培养后，后续操作同迁移实验。

1.2.11转染后细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达 细胞转染后继续培养48 h，收集转染后细胞，参照方法1.2.3 进行蛋白检测。

2 结 果

2.1所有对象组织中kisspeptin、kiss1r表达 与对照组比较，病例组中kisspeptin、kiss1r表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表1。

2.2kisspeptin、kiss1r表达与患者性激素水平关系 与kisspeptin、kiss1r阳性表达者比较，kisspeptin、kiss1r阴性表达者LH水平升高，PRL、E2、P水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

A：对照组；B：病例组

表1 绒毛组织中kisspeptin、kiss1r表达比较

a：P<0.05，与对照组比较

表2 kisspeptin、kiss1r表达与患者性激素水平关系

a：P<0.05，与kisspeptin阳性表达比较；b：P<0.05，与kiss1r阳性表达比较

2.3细胞中kisspeptin/kiss1r表达 与空白对照组、阴性转染组比较，kiss1r转染组细胞中kisspeptin、kiss1r蛋白表达水平均升高(P<0.05)，见图2、表3。

A：空白对照组；B：阴性转染组；C：kiss1r转染组

2.4细胞增殖情况 随着细胞培养时间延长，kiss1r转染组细胞增殖率逐渐升高，在同一时间点，与空白对照组、阴性转染组比较，kiss1r转染组增殖率均升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表3 转染后kisspeptin、kiss1r表达情况

a：P<0.05，与空白对照组比较；b:P<0.05，与阴性转染组比较

表4 转染后JAR、JEG-3细胞增殖率比较

a：P<0.05，与空白对照组比较；b:P<0.05，与阴性转染组比较

A：空白对照组；B：阴性转染组；C：kiss1r转染组

2.5细胞克隆形成情况 与空白对照组、阴性转染组比较，kiss1r转染组细胞菌落数量均升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3、表5。

表5 细胞菌落数量比较个)

a：P<0.05，与空白对照组比较；b:P<0.05，与阴性转染组比较

2.6细胞迁移、侵袭情况比较 与空白对照组、阴性转染组比较，kiss1r转染组细胞迁移、侵袭数量均升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4、表6。

2.7细胞中MMP-2、MMP-9的表达 与空白对照组、阴性转染组相比，kiss1r转染组细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达均升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5、表7。

A：空白对照组；B：阴性转染组；C：kiss1r转染组

表6 各组细胞迁移、侵袭数量比较个)

a：P<0.05，与空白对照组比较；b:P<0.05，与阴性转染组比较

A：空白对照组；B：阴性转染组；C：kiss1r转染组

表7 MMP-2、MMP-9表达情况

a：P<0.05，与空白对照组比较；b:P<0.05，与阴性转染组比较

3 讨 论

kisspeptin及其受体kiss1r与肿瘤的侵袭、迁移密切相关[5]。kisspeptin及其受体kiss1r的缺失可导致低促性腺激素功能减退，使生殖功能调控发生紊乱[7-8]。本研究显示复发性流产患者绒毛组织kisspeptin、kiss1r表达均低于对照组，与以往结果相符[9]，提示kisspeptin、kiss1r可能与复发性流产有关。ZABETIAN等[10]通过对复发性流产患者滋养层细胞中kisspeptin进行检测，结果显示其水平明显低于正常妊娠者。子痫前期、胎儿受限血清kisspeptin水平均低于正常妊娠者[11]，推测kisspeptin水平异常与胎盘功能不良相关，结合以往研究推测低水平kisspeptin、kiss1r与复发性流产有关。

本研究显示，kisspeptin、kiss1r阴性表达者LH水平升高，PRL、E2及P水平降低，表明kisspeptin、kiss1r表达与性激素水平有关。PRL为早期妊娠启动的主要激素，其水平的降低预示着排卵障碍、先兆性流产[12]。此外PRL降低至5 ng/mL以下则导致流产、胎儿死亡[13]。PRL水平降低影响卵巢功能，因此E2水平降低，而血清中LH水平升高，其原因可能与PRL、E2及P对垂体的反馈调控有关。以上结果提示kisspeptin、kiss1r表达异常可能会导致患者性激素水平的异常。

滋养细胞成功浸润到子宫组织并顺利着床在妊娠过程中十分重要，这一过程涉及细胞迁移、侵袭，与肿瘤的转移、侵袭相似。有研究显示滋养细胞侵袭能力降低会导致不良妊娠的发生[14-15]。本研究显示kiss1r转染组细胞菌落数量、细胞迁移、侵袭数量均升高，说明kiss1r与绒癌细胞的侵袭、迁移密切相关。MMP-2、MMP-9可完全降解胞外基质，促进滋养细胞的迁移、浸润，是调控滋养细胞侵袭能力的重要因子。吕珊珊等[16]研究显示MMP-9在妊娠7～11周达到高峰，说明MMP-9水平可能与滋养细胞侵袭能力有关。JIANG等[17]建立MMP-9缺失型小鼠模型发现小鼠先兆性流产率较高。本研究显示kiss1r转染组MMP-2、MMP-9表达降低，提示MMP-2、MMP-9可影响滋养细胞浸润，进一步提示kiss1r基因可能通过影响MMP-2、MMP-9促侵袭基因的表达，使滋养细胞侵袭能力出现异常调控，导致复发性流产。

综上所述，kisspeptin、kiss1r在复发性流产患者绒毛组织中呈低表达，促进绒癌的增殖、侵袭、转移，与复发性流产有关，但其具体作用机制至今尚未阐明，因此kisspeptin、kiss1r在复发性流产中的作用机制还有待深入研究。