红曲黄酒糟蛋白酶解物制备工艺优化及营养评价

林晓婕 何志刚 梁璋成 沈 萍 林晓姿 李维新

(福建省农科院农业工程技术研究所；福建省农产品(食品)加工重点实验室，福州 350003)

红曲黄酒是福建特产，目前福建省共有黄酒生产企业119家，年生产能力12.50×107L，在生产过程中能产生20%～30%的酒糟[1]，即产生2.5万t以上的红曲黄酒糟。红曲黄酒糟干基中含有20%～40%的蛋白质，其中以水不溶性的谷蛋白为主。此外，酒糟中还含有大量的霉菌、细菌、酵母等微生物及其自身的代谢产物。大米经过酿制，清蛋白所占比例略微提高，而球蛋白和谷蛋白所占比例降低，且不能完全溶解在碱溶液[2-3]。因此，相对于大米蛋白，黄酒糟中的蛋白溶解性较低，含有不溶性物质多，难以直接利用。利用酶解技术可将黄酒糟制成易于吸收利用的水解蛋白，可极大地提高产品的附加值，具有很好的经济和社会效益。

黄酒按酿造黄酒所使用的曲种分为麦曲黄酒和红曲黄酒。麦曲黄酒采用麦曲(添加量10%左右)、籼米或粳米为原料[4]，而红曲黄酒采用红曲(添加量2%～4%)、糯米为原料[5]。原料差异和酿制工艺的不同导致了麦曲黄酒糟和红曲黄酒糟成分的不同。麦曲黄酒糟蛋白质质量分数约为30%左右。舒进等[6]采用木瓜蛋白酶提取麦曲黄酒糟蛋白，未考虑酒糟中纤维素、淀粉等对蛋白质提取的影响。楼芳菲等[7]、左楠楠等[1]等采用碱性蛋白酶提取麦曲黄酒糟蛋白，未考虑酶解产品的风味及其应用。本实验所采用的红曲黄酒糟蛋白质质量分数约为40%，综合考虑纤维素、淀粉等物质的利用以及酶解产品的风味。通过项目组前期实验发现，添加纤维素酶、α-淀粉酶不仅可以酶解酒糟中的部分纤维素和淀粉转化为多糖，还可以释放出纤维和淀粉中包裹着的蛋白。因此，先进行纤维素酶、淀粉酶酶解后，再进行蛋白酶酶解，并通过酶解条件优化，提高蛋白的提取率，综合考虑红曲黄酒糟蛋白酶解物风味并对其进行营养评价，该蛋白酶解物可开发为优质的功能营养食品、调味品等。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

福建红曲黄酒糟，60 ℃烘干粉碎后备用，蛋白质质量分数38.2%，含水量10.3%，福建宁德黄家酒业。

纤维素酶(40 000 U/g)，α-淀粉酶(40 000 U/g)，碱性蛋白酶(200 000 U/g)、中性蛋白酶(200 000 U/g)、木瓜蛋白酶(200 000 U/g)、风味蛋白酶(15 000 U/g)、胃蛋白酶(10 000 U/g)，江苏锐阳生物科技有限公司。其他试剂均为分析级。

1.2 仪器与设备

Sorvall LYNX 6000高速落地离心机；DHG-9070型电热恒温鼓风干燥箱；UV-1750紫外可见分光光度计；ZDJ-400H滴定仪；Foss 2000自动凯氏定氮仪。

1.3 方法

1.3.1 红曲黄酒糟的前处理

以红曲黄酒糟和水固液比1∶10混合，先以纤维素酶酶解，反应pH 5，温度65 ℃，时间0.5 h，再以α-淀粉酶酶解反应pH 6.0，温度70 ℃，时间2 h。

1.3.2 蛋白酶的筛选实验

1.3.2.1 单酶酶解

取经前处理后的红曲黄酒糟，分别采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶进行酶解，pH、温度均按说明书推荐参数操作，酶解时间2 h，加酶量2 000 U/g，10 000 g离心15 min后收集上清液，测定蛋白含量。

表1 不同蛋白酶对蛋白提取率的影响

1.3.2.2 复合酶解

复合方式为：碱性蛋白酶+风味蛋白酶、中性蛋白酶+风味蛋白酶、碱性蛋白酶+风味蛋白酶，比例均为1∶1，加酶量2 000 U/g，10 000 g离心15 min后收集上清液，测定蛋白含量。

1.3.3 酶解工艺优化

1.3.3.1 复合蛋白酶酶解单因素实验

取经前处理的红曲黄酒糟，以复合酶比例(中性蛋白酶：风味蛋白酶)、固液比、pH、温度、时间和加酶量作为单因素，研究单因素对蛋白提取率的影响。

1.3.3.2 响应面优化设计

以蛋白提取率为指标，在四因素三水平上对pH、温度、时间、加酶量进行响应面优化。实验因素与水平见表1。

表2 实验设计因素及水平

1.3.4 红曲黄酒糟蛋白酶解物的感官评价

参照王雨生等[8]，采用综合评分法对红曲黄酒糟蛋白酶解物进行感官评价。感官评价由12位具有感官评定经验的食品专业人员，采用评分法对红曲黄酒糟蛋白酶解物的整体滋味进行评价。设定5个评价指标及权重系数，整体滋味通过加权法将各个指标的平均分加权相加，得出评分。评价标准：鲜味、香味、红曲黄酒糟特征风味、甜味、协调性评分均为0～5分，0分表示完全无鲜味、香味、红曲黄酒糟特征风味、甜味以及协调性差；分值越大，表示各指标越优，整体滋味越好。指标权重均为20%。

1.3.5 红曲黄酒糟蛋白酶解物的营养评价

化学评分(chemical score，CS)：参照联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization of the United，FAO)的方法[9]。

氨基酸评分(amino acid score，AAS)：样品中必需氨基酸质量分数占FAO和世界卫生组织(World Health Organization，WHO)模式中相应氨基酸质量分数的比例[9]。

必需氨基酸指数(essential amino acid index，EAAI)：样品蛋白质中各种必需氨基酸含量与标准蛋白质中相应的各种氨基酸含量之比的加权平均值[10]。

生物价(biological valence，BV)：BV=1.09×EAAI-11.7。

营养指数(nutritional index，NI)：EAAI与蛋白质质量分数的乘积[11]。

氨基酸比值系数分(score of ratio coefficient ofamino acid，SRCAA)：参照陈丽丽等[11]的方法进行测定。

1.3.6 检测方法

1.3.6.1 蛋白质含量：参照GB 5009.5—2016食品中蛋白质的测定方法。

1.3.6.2 肽含量：参照朱俊颖[12]等方法测定。

适量取2种粉碎样品,将少许微胶囊粉末撒于贴了双面胶的样品台上,吹去多余粉末,喷金30 s后用高分辨场发射扫描电子显微镜观察样品形态并拍照。

1.3.6.3 氨基酸分析：采用GB/T 5009.124—2003食品中氨基酸的测定中所列方法测定氨基酸含量。

1.3.7 数据处理

使用DPS3.01、Design-Expert.V8.0.6软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 红曲黄酒糟的预处理

以纤维素酶和淀粉酶预处理红曲黄酒糟，可使原料结构松散，释放被束缚的大多数水溶性蛋白，并使得淀粉酶和蛋白酶能够进入内部促进蛋白的降解和溶解[13-14]。大米蛋白存在于淀粉颗粒的外表面或填充在淀粉颗粒中，通过二硫键形成网络结构，与淀粉紧密结合[15-16]。α-淀粉酶可水解淀粉，部分糖类物质与不溶性蛋白质分离，蛋白质并未水解，但其网络结构在淀粉酶解的过程中显示出蛋白凝胶体的骨架，使得蛋白的作用位点暴露更有利于蛋白酶的作用。蛋白酶酶解将蛋白水解成短肽，打开蛋白的二级结构，肽链展开，使得更多的亲水集团暴露，从而促进了蛋白溶出[17-18]。经对比实验，可提高蛋白提取率9.72%。

注：C：蛋白酶；A+C：纤维素酶+蛋白酶；B+C：淀粉酶+蛋白酶；A+B+C：纤维素酶+淀粉酶+蛋白酶图1 不同预处理对蛋白提取率的影响

2.2 蛋白酶的筛选结果

2.2.1 单酶酶解

由图2可见，各蛋白酶对酒糟蛋白水解能力之间存在较大差异，碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶的的蛋白提取率较高，分别达50.63%、47.04%和44.71%，与其他各处理间的差异均达极显著水平(P<0.01)。谷蛋白占大米蛋白的70%～90%，分子内和分子间广泛存在的二硫键以及分子内存在的巯基，交联凝聚形成谷蛋白，因此，造成谷蛋白较低的水溶性[19-21]。通过蛋白酶的降解和修饰，对蛋白分子在不同位点进行切割，二硫键打开，蛋白降解为可溶性多肽和部分氨基酸，溶解性得到改善。由于碱性蛋白酶具有广泛的消化位点，因此具有较好的酶解效果[22]。碱性蛋白酶酶解液具有较好的鲜味，但香味等其他感官指标评分不佳，导致整体滋味一般。中性蛋白酶酶解液和风味蛋白酶酶解液，兼具较好的提取率和感官评分。因此，后续实验采用碱性蛋白酶分别和中性蛋白酶、风味蛋白酶复合，中性蛋白酶和风味蛋白酶复合，以期获得更优的蛋白提取率和改善酶解液风味。

注：横坐标1～5分别为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶图2 蛋白酶对蛋白提取率和感官评分的影响

2.2.2 复合酶酶解

复合酶解实验结果如图3所示。图3表明，中性蛋白酶和风味蛋白酶的复合酶解提取率达47.97%，高于中性蛋白酶和风味蛋白酶单酶提取率，达极显著(P<0.01)水平。同时，酶解液具有较好的鲜味、香味、红曲黄酒糟特征风味，整体协调性较好，与两种单酶酶解风味比较，具有更好的整体滋味。中性蛋白酶和风味蛋白酶虽然能一定程度改善碱性蛋白酶酶解液风味，但效果不显著。同时，由于两种酶均不处于最适酶解条件，或者只有一种酶处于最适酶解条件，导致蛋白提取率较低。因此，后续实验采用中性蛋白酶和风味蛋白酶复合酶解并进行优化。

注：横坐标1～3分别为碱性蛋白酶+风味蛋白酶、中性蛋白酶+风味蛋白酶、碱性蛋白酶+中性蛋白酶图3 复合蛋白酶对蛋白提取率和感官评分的影响

2.3 蛋白酶酶解单因素实验设计

黄酒糟经纤维素酶、淀粉酶处理后，在不同的复合酶比例(中性蛋白酶：风味蛋白酶)、固液比、pH、温度、时间和加酶量条件下使用复合酶酶解，研究不同酶解条件对蛋白提取率的影响。实验结果见图4。

图4 各因素对蛋白提取率的影响

图4表明，复合酶比例(中性蛋白酶：风味蛋白酶)对蛋白提取率的影响呈先上升后下降的趋势，当中性蛋白酶：风味蛋白酶为2∶1时，蛋白提取率达54.64%。随着固液比的降低，蛋白提取率呈先快速上升后趋于平缓的趋势。当固液比为1∶10和1∶12时，有利于酶与底物反应充分，蛋白提取率分别达54.64%和55.72%，差异未达显著水平(P>0.05)，综合经济成本考虑，适宜的固液比为1∶10。随着pH的上升，蛋白提取率呈先上升后下降的趋势，pH值7.0的处理蛋白提取率最高。温度为50 ℃的处理蛋白提取率最高，达54.64%，各处理间差异均达极显著水平(P<0.01)。当温度超过50 ℃，蛋白酶活性逐渐失活，酶解度降低。随着酶解时间的延长，蛋白提取率呈先快速上升后趋于平缓的趋势。酶解时间2 h与3 h的蛋白提取率无显著差异。随着固液比的降低，蛋白提取率呈先快速上升后趋于平缓的趋势。随着加酶量的增加，蛋白提取率呈先快速上升后趋于平缓的趋势，当加酶量为2 500 U/g时，蛋白提取率为59.41%，与加酶量3 000 U/g处理的61.04%差异不显著(P>0.05)。从经济成本考虑，适宜的蛋白酶加酶量为2 500 U/g。

2.4 响应面优化实验设计

2.4.1 Box Behnken设计与结果

根据Box Behnken设计原理，在pH、温度和时间、加酶量上进行29个实验点的响应面分析实验。实验方案和结果见表3。

表3 响应面法实验方案及结果

2.4.2 二次回归模型与方差分析

利用Design Expert 8.0.5软件进行多元回归拟合分析，建立蛋白提取率对pH、温度、时间、加酶量4个自变量的二次多项式回归模型，回归系数R2=0.984 7。

Y=+59.42-3.12X1+0.88X2+2.87X3+1.99X4-1.65X1X2-1.85X1X3-0.40X1X4+0.45X2X3+0.93X2X4+0.20X3X4-3.48X12-4.12X22-2.31X32-2.24X42

方差分析结果见表4。该模型达到极显著水平(P<0.01)，失拟项不显著，回归效果好，可信度高。4个因素对综合值影响主次顺序：X1(pH)>X3(时间)>X4(加酶量)>X2(温度)，均达到极显著水平。交互项X1X2、X1X3对蛋白提取率的影响极显著，交互项X2X4对蛋白提取率的影响显著。

2.4.3 交互作用因子分析

交互项中pH和温度、pH和时间对蛋白提取率的影响极显著(P<0.01)，温度和加酶量对蛋白提取率的影响显著(P<0.05)。等高线图的椭圆形排列较密集，说明因素变化对响应值影响较大，若调整pH、温度、加酶量至最适水平，应可显著提高蛋白提取率。

表4 回归模型方程方差分析

注：**表示极显著(P<0.01)，*表示显著(P<0.05)。

2.4.4 最佳工艺预测与验证

黄酒糟蛋白与大米胚乳蛋白相似。大米胚乳蛋白由60%～65%的PB—Ⅱ型蛋白、20%～25%PB—I型蛋白以及10%～15%清蛋白组成[15]。采用中性蛋白酶和风味蛋白酶复合酶解PB—Ⅱ型蛋白和清蛋白，具有较好的酶解效果。通过利用Design Expert 8.0.5软件模型进行优化，计算得出最佳的工艺参数为：pH 6.15，温度52.0 ℃，时间3 h，加酶量2 825 U/g在此条件下，蛋白提取率为63.06%。为了验证模型预测结果的准确性，在模型优化的工艺参数下进行实验，3次重复，蛋白提取率分别为63.75%、63.64%、63.47%，平均值63.62%，模型拟合度较好。

2.5 黄酒糟蛋白酶解物的营养评价及风味氨基酸

黄酒糟蛋白酶解物中非需氨基酸质量分数分别为天门冬氨酸10.90%、谷氨酸14.30%、丝氨酸5.42%、组氨酸2.36%、精氨酸4.97%、甘氨酸6.04%、脯氨酸5.37%、丙氨酸5.32%。黄酒糟蛋白酶解物中必需氨基酸质量分数及营养评分表如表5。黄酒糟蛋白酶解物18种氨基酸总质量分数为88.91%，第一限制性氨基酸为色氨酸，占总氨基酸的0.75%。黄酒糟蛋白酶解物中必需氨基酸占总氨基酸的41.30%。在必需氨基酸中质量分数最高为亮氨酸8.36%。表5表明，除蛋氨酸、半胱氨酸和色氨酸以外，各必需氨基酸CS较大，与标准鸡蛋蛋白的对应必需氨基酸组成接近。由于谷物中赖氨酸含量低，且在加工过程中易被破坏，故赖氨酸为大部分谷物的第一限制性氨基酸，同时赖氨酸也是人体的第一必需氨基酸。黄酒糟蛋白酶解物中赖氨酸AAS较高，这可能是因为，在红曲黄酒发酵过程中微生物代谢产生。赖氨酸具有协助人体吸收利用其他营养物质、促进生长发育、增强免疫功能、提高中枢神经组织等重要功能[10]。因此，黄酒糟蛋白酶解物营养均衡优于谷物。黄酒糟蛋白酶解物的EAAI、BV、NI分别为76.52、71.70、74.99，说明黄酒糟蛋白酶解物可被机体吸收利用程度较高。SRCAA为79.03，表明黄酒糟蛋白酶解物中各种必需氨基酸偏离模式氨基酸的离散度较小，营养价值相对较高，可以确定黄酒糟蛋白酶解物为一种优质的蛋白来源。

黄酒糟蛋白酶解物中鲜味氨基酸(天门冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸)和甘氨酸总质量分数达53.50%，具有良好的鲜味和甘味，可用于开发高档风味调味品以及作为功能食品添加剂等。肽含量达22.4 g/L，优于分段水解，后续可进行多肽调味液的研发。

表5 氨基酸组成与评分

3 结论

研究结果表明，最佳酶解工艺为：以红曲黄酒糟和水固液比1∶10，以纤维素酶和淀粉酶酶解预处理黄酒糟，选用中性蛋白酶和风味蛋白酶以2∶1比例复合后，在pH 6.15，温度52.0 ℃，时间3 h，加酶量2 825 U/g条件下酶解，蛋白提取率达63.62%。黄酒糟蛋白酶解物中鲜味氨基酸(天门冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸)和甘氨酸总质量分数达53.50%，具有良好的鲜味和甘味。黄酒糟蛋白酶解物必需氨基酸指数、生物价、营养指数和氨基酸比值系数分分别为76.52、71.70、74.99、79.03，营养均衡、合理，是一种优质的蛋白质资源，可用于开发高档调味品以及作为功能食品添加剂等。