人肝癌相关抗原SMP30重组慢病毒对人外周血树突状细胞成熟的影响

张瑶尧，黄荣师，郭晋宏，潘剑，陈承晓，黄天明，覃秋红，罗国容

(广西医科大学，南宁530021)

衰老标记蛋白30(SMP30)最早作为一种钙调节蛋白被日本学者Yamaguchi等[1]发现。随后，Fujita等[2]发现，SMP30是一种随年龄增加而水平不断下降、相对分子质量约为34 kD的抗衰老蛋白。人SMP30主要存在于肝细胞中。在不同的脊椎动物中SMP30的氨基酸序列具有高度的保守性，即其同源性可达70%～90%。SMP30具有多种生物学功能，其中包括对肝细胞的保护作用和对肝细胞再生的调节作用[3]。我们在前期研究中用SEREX技术筛选出编号为HCC-22-5的人肝细胞癌(HCC)相关抗原与人SMP30羧基端100%同源，血清学初筛结果显示在HCC患者血清中存在HCC-22-5抗原的相应抗体，从而最先提出SMP30是一种人肝癌相关抗原，具有良好的免疫原性[4]。用人SMP30重组蛋白致敏人外周血血树突状细胞(DC)后可对DC的成熟起到促进作用，且能有效刺激自体T淋巴细胞增殖，诱导生成对人肝癌细胞株BEL-7404有杀伤作用的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，但致敏时间有限[5]。用与人肝癌相关抗原SMP30同源性很高的小鼠SMP30构建慢病毒载体，体外转染小鼠外周DC并使其稳定表达SMP30蛋白，证明小鼠SMP30重组慢病毒体外转染小鼠外周血DC对其成熟起到一定促进作用[6]。2017年7月～2018年7月，我们进一步用人肝癌相关抗原SMP30重组慢病毒转染人外周血DC，观察其对DC成熟的影响，为后续进一步研制人肝癌相关抗原DC疫苗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 人外周血淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)购自广州赛业生物科技有限公司；人肝癌相关抗原SMP30重组慢病毒和空载慢病毒由课题组配合广州复能基因有限公司制备；哺乳动物蛋白试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购自杭州弗德生物科技有限公司；Western blotting检测试剂盒购自赛默飞世尔科技有限公司；PVDF膜购自美国BD公司；兔抗人SMP30多克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体和HRP标记的山羊抗兔 IgG抗体购自美国Novus公司；白细胞介素12(IL-12)和干扰素γ(INF-γ)的ELISA检测试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；人Fitc-CD1a、Fitc-CD80、PE-CD86流式标记抗体购自美国BioLegend公司；R/MINI-1640培养基、胎牛血清、胰酶和双抗购自美国Giboco公司。超净工作台购自苏州尚田洁净技术有限公司；二氧化碳培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司；台式高速离心机TG16-WS购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Beckman 64R 高速冷冻离心机购自上海普迪生物技术有限公司；全自动荧光倒置及相差倒置显微镜购自日本Olympus公司；酶标仪购自美国Thermo公司；流式细胞仪购自美国BD公司；UVI 凝胶成像分析系统购自日本Olympus公司。

1.2 人外周血DC的分离与体外培养 采用Ficoll密度梯度离心法。抽取健康志愿者外周血100 mL，加等量的PBS缓冲液稀释。将稀释好的血液缓慢沿离心管壁加到等量的人外周血淋巴细胞分离液上，室温避光静置20 min。室温下2 000 r/min离心25 min，吸取白膜层。加等量PBS缓冲液清洗，室温下1 500 r/min离心10 min后移去上清液，再加PBS缓冲液重复清洗1次。用R/MINI-1640完全培养基重悬分离得到的人外周血单个核细胞，接种于6孔板中，约5×106/孔，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h，移去非贴壁细胞，用PBS缓冲液清洗2次贴壁细胞，加入含100 ng/mL GM-CSF和50 ng/mL IL-4的R/MINI-1640完全培养基继续培养，隔天半量换液。

1.3 人外周血DC的鉴定 在普通光学显微镜下观察、记录细胞形态变化。收集培养第5天的细胞，对细胞进行计数，细胞数约为5×105个，PBS缓冲液清洗2次，离心后移去上清液，用预冷的PBS缓冲液100 μL重悬细胞，加入Fitc-CD1a流式标志抗体5 μL，冰上避光孵育30 min，1 000 r/min离心5 min后移去上清液，PBS缓冲液清洗细胞1次，每管加入PBS缓冲液500 μL重悬细胞，在1 h 内用流式细胞仪进行检测。

1.4 慢病毒体外转染 DC培养第6天，将其随机分为SMP30慢病毒组、空载慢病毒组和空白对照组，分别用人肝癌相关抗原SMP30重组慢病毒和空载慢病毒(感染复数=85)进行体外转染，并加入2 μg/mL的polybrene，每组设3个复孔。转染12 h，于普通光学显微镜下观察细胞状态，细胞无异常继续培养至转染24 h后，换新鲜的R/MINI-1640完全培养基继续培养，72 h后开始用荧光显微镜观察EGFP绿色荧光蛋白的表达情况。

1.5 DC中SMP30蛋白表达检测 采用Western blotting法。在荧光显微镜下观察到明显绿色荧光后，用哺乳动物蛋白试剂盒提取各组DC的总蛋白，BCA蛋白定量法检测提取的各组DC总蛋白浓度。具体实验步骤按试剂盒操作说明进行。Western blotting检测各组DC表达SMP30蛋白的表达情况。实验前1 d制备5% SDS-PAGE浓缩胶和10% SDS-PAGE分离胶，4 ℃冰箱保存；加样到5% SDS-PAGE浓缩胶和10% SDS-PAGE分离胶上在100 V稳电压下电泳1.5 h；根据一抗SMP30和内参GAPDH的大小进行切胶；100 mA稳电流转到PVDF膜上，转膜时间为1.5 h；5%脱脂牛奶室温下封闭2 h；PBST洗膜3次、清洗时间为10 min/次；4 ℃下孵育一抗(兔抗人SMP30多克隆抗体，1∶600稀释和内参抗体兔抗人GAPDH多克隆抗体，1∶2 000稀释)过夜；PBST洗膜3次、10 min/次；室温下孵育二抗(山羊抗兔 IgG抗体，1∶10 000稀释)2 h；PBST洗膜3次、10 min/次；在PVDF膜上滴上新鲜配好的ECL发光液，用UVI凝胶成像分析结果。

1.6 DC细胞因子的分泌情况检测 采用ELISA法。转染后第8天吸取各组DC的培养上清液，4 ℃、14 000 r/min离心5 min后取上清液，用ELISA试剂盒检测各组DC细胞因子IL-12、INF-γ的分泌情况。

1.7 DC表面分子CD80、CD86表达检测 采用流式细胞术。收集各组DC，用PBS缓冲液清洗2遍，用预冷的PBS缓冲液重悬细胞后对细胞进行计数，确保每个EP管中100 μL细胞悬液中含5×105个细胞，各管分别加入带Fitc-CD80和PE-CD86流式标记抗体5 μL，冰上避光孵育30 min，1 000 r/min离心5 min后移去上清液，PBS缓冲液清洗细胞1次，每管加入PBS缓冲液500 μL重悬细胞，在1 h 内用流式细胞仪测算CD80、CD86表达率。

2 结果

2.1 人外周血DC的体外培养与鉴定结果 分离人外周血获得单个核细胞后，用细胞因子GM-CSF和IL-4诱导其生成DC。普通光学显微镜下观察到未成熟的DC细胞形态不规则，细胞集落明显，贴附在孔板壁上生长；成熟的DC细胞形态呈类圆形，集落不再明显，细胞表面有短的毛刺状突起，多呈悬浮生长。诱导培养第5天，流式细胞术检测DC表面分子CD1a的表达率为68.2%，说明成功将人外周血单个核细胞诱导培养成DC。

2.2 慢病毒转染人外周血DC结果 转染第5天在荧光显微镜下可观察到SMP30慢病毒组和空白对照组出现少量绿色荧光，第7天荧光蛋白表达趋于稳定，DC转染率75%左右，空白对照组荧光显微镜下未观察到绿色荧光。

2.3 各组SMP30蛋白表达比较 SMP30慢病毒组在34 kD处出现明显反应条带，与目的SMP30蛋白的相对分子质量大小一致；而空载慢病毒组和空白对照组无明显反应条带。SMP30慢病毒组成功过表达目的蛋白SMP30。

2.4 各组细胞因子分泌情况比较 SMP30慢病毒组、空载慢病毒组和空白对照组上清液中IL-12水平分别为(32.56±2.93)、(21.13±1.55)、(15.68±1.73)pg/mL，INF-γ水平分别为(42.34±5.82)、(21.68±2.23)、(14.14±2.16)pg/mL。SMP30慢病毒组上清液中IL-12、INF-γ水平高于空载慢病毒组、空白对照组(P均<0.05)。

2.5 各组CD80、CD86表达比较 SMP30慢病毒组、空载慢病毒组和空白对照组上清液中CD80表达率分别为48.7%、32.4%、18.1%，CD86表达率分别为21.0%、18.0%、10.2%。SMP30慢病毒组CD80、CD86表达率高于空载慢病毒组、空白对照组(P均<0.05)。

3 讨论

肿瘤免疫治疗近年来受到了众多学者的关注，主要原因是肿瘤免疫治疗可以减少手术、放疗、化疗等传统常规疗法对肿瘤患者免疫系统的损伤，并对晚期肿瘤患者的疗效优于传统常规疗法。DC是目前发现的机体内功能最强大的抗原呈递细胞，在免疫应答过程中具有无法取代的地位，并且DC可在体外成功培养，使得以DC为基础的肿瘤免疫治疗成为国内外的研究热点[7]。Sipμleucel-T 在2010年成为第一个被FDA批准的治疗性肿瘤DC疫苗[8]。

目前，用于肿瘤免疫治疗的DC疫苗大致分为肿瘤抗原或多肽致敏的DC疫苗和基因修饰的DC疫苗两类[9]。本课题组在前期实验中证明人肝癌相关抗原SMP30重组蛋白致敏人外周血DC后可促进DC的成熟和活化，但是这种方式获得的DC疫苗持续作用时间有限。与肿瘤抗原或多肽致敏的DC疫苗相比，基因修饰的DC疫苗具有可长期表达抗原和细胞因子或共刺激分子、促进DC的成熟和活化、增强DC的抗原呈递能力、诱导T淋巴细胞生成特异性CTL以及对抗肿瘤对DC的抑制等优点[10，11]。基因修饰的DC疫苗是借助分子生物学手段将外源性基因以基因转移的方式导入DC内部来获得的，目前最为常用的方式之一是用慢病毒载体将目的基因转至DC[12]。主要原因为慢病毒载体具有可转染非分裂细胞、转染率高、可承载较大的外源基因片段且稳定表达的优点[13]。本课题通过用构建肝癌相关抗原SMP30慢病毒载体后再用其转染DC的方式，以求获得SMP30相关的更稳定、更持续作用的DC疫苗。在前期实验中，本课题组发现用与人SMP30有高度同源性的小鼠SMP30慢病毒转染小鼠DC后可以促进DC的成熟，且比SMP30蛋白致敏的DC疫苗持续时间更长。在此研究基础上，本研究用人肝癌相关抗原SMP30重组慢病毒在体外转染人外周血DC后，检测其对DC功能的成熟状况的影响，从而探讨该种方式是否适用于人。CD1a是目前最常用来鉴定人DC细胞的检测指标，在人外周血DC诱导培养的过程中，先通过对细胞形态的观察和流式细胞术鉴定DC表面因子CD1a的表达情况来确定了人外周血DC的成功培养。结果说明成功用人SMP30重组慢病毒在体外转染人外周血DC，并且使DC成功过表达目的蛋白SMP30。DC在不同的状态下表达的表面免疫分子和分泌的细胞因子有所不同，其中，只有成熟的DC才会高表达协同刺激分子(CD80、CD86)、黏附分子、特征性标记等，并分泌IL-12、TNF-α、IFN-α、IFN-γ等细胞因子[14]。本研究采用ELISA和流式细胞术来检测DC的成熟情况，两种检测结果均显示人SMP30慢病毒转染人外周血DC后能促进DC的成熟。该结果与本课题组在前期研究中发现的小鼠SMP30慢病毒可以促进小鼠DC成熟具有一致性，为后续实验进一步研究人肝癌相关抗原SMP30致敏的DC疫苗及其对肝癌的杀伤作用提供了实验基础。