沉默GTPBP4基因对结肠癌细胞生物学行为的影响及机制

唐丹，刘勋，杨志惠

(1西南医科大学，四川泸州646000；2西南医科大学附属医院)

结肠癌(CRC)是我国消化系统好发的恶性肿瘤之一，其发病率居肿瘤第3位，致死率居肿瘤第5位[1]。结肠癌的发病率及致死率呈逐年上升趋势，但发病机制目前仍不清楚。目前结肠癌的治疗多采用手术联合放化疗为主，但有部分患者确诊时已无手术指征，靶向治疗成为治疗结肠癌的重要突破点。GTP结合蛋白4(GTPBP4)基因，又名脑红蛋白基因、核仁G蛋白1基因，定位于人染色体10p15-14[2]。GTPBP4基因在真核生物核糖体60S亚基合成和成熟过程中起关键作用[3]，与秀丽隐杆线虫的生长发育、寿命、脂肪代谢等密切相关，过表达GTPBP4基因将会导致其寿命缩短[4]。GTPBP4与肿瘤的发生发展密切相关。GTPBP4高表达与结直肠癌细胞迁移、侵袭和转移有关，并且结直肠癌患者高表达GTPBP4预后差[5]。目前有研究发现结肠癌细胞GTPBP4基因敲除后，会引起p53积累，肿瘤细胞增殖受到抑制[6]。p53基因存在两种形式，野生型p53是公认的肿瘤抑制基因，其过表达或激活将引发肿瘤细胞死亡，低表达或失活则会导致肿瘤发生。抑癌基因p53可以下调凋亡抑制蛋白survivin的表达，而这种负性调节作用能够诱导细胞凋亡[8]。目前关于GTPBP4基因在结肠癌生物学行为方面的作用及与野生型p53、Survivin相关性的研究相对较少。2017年6月～2018年2月，本研究将GTPBP4-RNAi干扰慢病毒转染至结肠癌HT29细胞，观察GTPBP4基因沉默后细胞生物学行为的改变，并探讨与p53、Survivin的联系。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 结肠癌细胞株HT29(上海中科院)；pGCSIL-GFP/GTPBP4-RNAi慢病毒载体(上海吉凯基因科技有限公司)，细胞周期试剂盒(碧云天公司)，细胞凋亡试剂盒(上海凯基)，Transwell小室(Costar公司)，CCK-8试剂(同仁化学研究所)，兔抗人GTPBP4单克隆抗体(Abcam公司)，鼠抗人P53单克隆抗体、兔抗人Survivin单克隆抗体(Cell signaling TEC公司)，鼠抗人GAPDH单克隆抗体(BI公司)；CO2细胞培养箱(Thermo公司)，倒置显微镜、荧光显微镜(日本Olympus)，PCR扩增仪(Roche480)，紫外分光光度计(艾德)，流式细胞仪(BD公司)。

1.2 HT29细胞慢病毒转染 胰酶消化对数生长期的HT29细胞，离心收集后，以5×104/mL将细胞悬液接种于6孔板中，于37 ℃、5% CO2的条件培养箱中培养至细胞融合度达30%，随机分为转染组与阴性对照组，转染组加入适量GTPBP4-RNAi慢病毒(感染复数值为10)，阴性对照组转染含有非特异性干扰序列的阴性病毒。感染48～72 h观察该细胞荧光的表达情况，当荧光表达率大于80%，收集细胞提取RNA和蛋白，以Real-time PCR和Western blotting证实转染成功。

1.3 细胞增殖能力检测 采用CCK8法。取感染72 h后两组细胞，胰酶消化制成细胞悬液，分别接种到96孔板中，每孔接种体积100 μL，细胞数约1 000个，每组设6个复孔；96孔板放入孵箱内继续培养24、48、72、96 h后，更换新鲜无血清培养基100 μL，各加入CCK-8 10 μL，放入37 ℃孵箱继续培养4 h，用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度。

1.4 细胞迁移能力检测 采用划痕实验。接种细胞前用记号笔在6孔板背后均匀地划横线，每孔5条线。将感染后的两组细胞消化离心后，每孔加入约5×105个细胞。第2天用10 μL枪头垂直于背后的横线划痕。用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，再加入无血清培养基。放入37 ℃、5% CO2培养箱培养。按0、24、48 h观察细胞划痕愈合情况，拍照。

1.5 细胞侵袭能力检测 采用Transwell实验。取转染后处于对数生长期的细胞，胰酶消化后制成细胞悬液，向准备好的Transwell小室上层中加入1×105个细胞。下室中加入500 μL含10% FBS的完全培养基，每组设立5个复孔，培养24 h。4%多聚甲醛固定小室15 min，倒转放置，风干。0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗3次。显微镜下观察，随机计数10个高倍视野穿过基质胶的细胞数，取平均值。

1.6 细胞周期检测 采用流式细胞术。取处于对数生长期的两组细胞，胰酶消化后，以2 000 r/min离心5 min收集细胞沉淀，PBS洗涤离心3次后，进行PI染色，室温避光孵育，流式细胞仪上机检测。

1.7 细胞凋亡检测 采用AnnexinⅤ-APC单染法。取处于对数生长期的两组细胞，胰酶消化后，PBS洗涤离心，收集细胞沉淀；1×binding buffer液洗涤细胞沉淀1次，以2 000 r/min离心5 min，收集细胞；细胞沉淀加入1 mL 1×staining buffer重悬；取细胞悬液100 μL(1×105～1×106个细胞)，加入AnnexinV-APC 5 μL进行染色，室温避光孵育15 min后，转移至流式细胞仪进行检测，每组重复3次。

1.8 细胞克隆形成实验 胰酶消化法收集对数生长期的两组细胞，制成细胞悬液，重悬后进行细胞计数。6孔板每孔接种1×104个细胞，每个转染组设3个复孔。于CO2恒温孵箱中继续培养细胞，培养期间每3天观察一次细胞生长状态并且换液，细胞连续培养2周后终止；用PBS洗涤后每孔加入1 mL多聚甲醛液，固定30～60 min后，PBS 洗涤。再每孔加入无杂质结晶紫染液500 μL，染色20 min，ddH2O洗涤多余染料后，计数，拍照。

1.9 细胞内p53、Survivin蛋白表达检测 采用Western blotting。RIPA裂解法提取细胞总蛋白，采用BCA法对蛋白进行定量，加入PBS和Loading Buffer 补齐，99 ℃变性10 min。 配置10%的分离胶和5%的浓缩胶，经恒压60 V电泳0.5 h后转为恒压120 V继续电泳1.5 h，电转100 V 2 h至PVDF膜，5%的脱脂奶粉(或BSA)封闭2 h，根据相关蛋白的分子量切胶后，分别加入p53、Survivin抗体(1∶1 000)及GAPDH抗体(1∶2 000)，4 ℃摇床孵育过夜。1×TBST洗膜4次，每次5 min，加入二抗后室温下摇床孵育1 h，再次1×TBST洗膜4次，并运用ECL法检测。Image J软件分析各条带灰度值。蛋白相对表达量=目的基因灰度值/内参灰度值。

1.10 细胞内p53、Survivin蛋白定位检测 采用细胞免疫荧光法。取感染后处于对数生长期的两组细胞，胰酶消化离心，按每孔5×105个细胞接种于装有盖玻片的6孔板中，待细胞贴壁后加入30 mg/L DADS。继续培养24 h。取出盖玻片，PBS洗涤，用多聚甲醛固定30 min。0.5% Triton X-100通透细胞20 min，PBS洗涤3次。山羊血清封闭30 min。加入一抗，4 ℃孵育过夜。PBS清洗后，加入二抗，室温湿盒内避光孵育2 h。PBS洗涤。DAPI避光下复染细胞核10 min。最后封片，显微镜检测荧光表达情况。

2 结果

2.1 沉默GTPBP4基因对HT29细胞增殖能力的影响 培养24、48、72、96 h转染组OD值分别为0.77±0.01、1.06±0.02、1.64±0.02、2.10±0.06，阴性对照组分别为0.92±0.03、1.34±0.04、2.27±0.02、3.17±0.09。各时间点转染组细胞增殖能力较阴性对照组低(P均<0.05)。

2.2 沉默GTPBP4基因对HT29细胞迁移能力的影响 划痕后48 h，转染组相对迁移距离(500.01±1.82)较阴性对照组(781.23±10.51)短(P<0.05)。

2.3 沉默GTPBP4基因对HT29细胞侵袭能力的影响 接种48 h后，转染组穿膜细胞数(91±4)个/5HPF，阴性对照组为(263±12)个/5HPF，转染组穿膜细胞数较阴性对照组少(P<0.05)。

2.4 沉默GTPBP4基因对HT29细胞周期的影响 转染组G1期细胞比例(82.16%)较阴性对照组(62.56%)高，G2期细胞细胞比例(5.91%)较阴性对照组(6.17%)低，S期细胞比例(11.93%)较阴性对照组(31.27%)低。两组各周期细胞分布比例比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.5 沉默GTPBP4基因对HT29细胞凋亡的影响 转染组细胞凋亡率(30.09%)较阴性对照组细胞(9.41%)高(P<0.05)。

2.6 沉默GTPBP4基因对细胞克隆形成的影响 转染组克隆形成的细胞集落数目为(68±2)个/孔，阴性对照组为(115±3)个/孔，转染组克隆形成的细胞集落数目较阴性对照组少(P<0.05)。

2.7 沉默GTPBP4基因对细胞内p53及Survivin蛋白表达的影响 转染组p53及Survivin蛋白相对表达量分别为1.339 8±0.013 6、0.453 3±0.027 5，阴性对照组分别为0.747 1±0.100 9、0.856 8±0.079 0。与阴性对照组比较，转染组p53蛋白相对表达量高(P<0.05)，Survivin蛋白相对表达量低(P<0.05)。

2.8 两组蛋白定位情况 两组p53、Survivin蛋白均主要表达于细胞核，未发生表达位置改变。

3 讨论

GTPBP4编码的GTP结合蛋白4，是由633个氨基酸组成的重要功能蛋白[8]，定位于细胞核。GTPBP4在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色。GTPBP4在神经鞘瘤中结合merlin，通过抑制cyclinD1表达，最终抑制肿瘤细胞增殖[9]。与以上研究结果相反，Lunardi[6]等发现GTPBP4的表达与野生型p53乳腺癌患者生存率呈负相关。GTPBP4高表达与结直肠[5]、肝癌[10]细胞迁移、侵袭和转移有关，并且GTPBP4高表达患者预后差。本研究发现，在有效敲减GTPBP4基因后，结肠癌细胞的周期阻滞、克隆形成明显减少，细胞凋亡率升高，细胞侵袭能力减弱。提示GTPBP4可能是癌基因。

p53是一种肿瘤抑制因子，常在人类肿瘤中发生突变[11]，突变后的p53由癌基因转变为抑癌基因，具有促进肿瘤细胞增殖、生长，而抑制肿瘤细胞凋亡的作用，可以抵消野生型p53的正常功能[12,13]。本研究沉默GTPBP4基因后，HT29细胞内p53蛋白表达升高，细胞一系列的生物学行为受到抑制。同时有研究指出药物刺激等外界因素作用，能使HT29细胞的突变型p53恢复为野生型p53[14]。据此推测，沉默GTPBP4基因后，细胞内表达的p53蛋白可能主要以野生型为主。在后续实验中可通过检测野生型p53下游靶基因P21、Hdm2等的表达加以验证。研究显示GTPBP4是p53的阴性调控子，能直接结合p53，导致其肿瘤抑制作用减弱[6]。沉默GTPBP4后，肿瘤细胞的增殖能力降低，而凋亡增加，p53蛋白表达上调，Survivin蛋白表达降低。可能由于GTPBP4对p53的抑制作用减弱，引起p53表达上调。另外，由于GTPBP4是核糖体60S晚期生物合成和成熟的关键因素，则GTPBP4可能通过核糖体-Mdm2-p53信号轴增强p53的核内表达，进而影响细胞增殖和凋亡。当各种原因导致核糖体RNA合成减少，核仁处于应激状态时，核糖体-Mdm2-p53通路被触发，即核糖体与MDM2相互作用激活p53。在应激条件下，磷酸化的p53从MDM2-p53复合物中解离，而MDM2是p53的负性调节蛋白以及E3泛素化连接酶，磷酸化的p53进一步抑制MDM2-P53的结合，MDM2介导的p53泛素化降解反应受到抑制后，p53表达上调[15]。细胞表达野生型p53或p21(Cip1)使细胞周期阻滞在G1期。也有研究表明野生型p53能抑制Survivin的mRNA及蛋白表达水平，对survivin有负性调节作用，其机制是p53对Survivin启动子中染色质的修饰，致使其沉默[16]。Survivin属于凋亡抑制蛋白家族成员之一，能促进肿瘤细胞增殖、血管生成，并具有抗凋亡等生物学功能[17]。已经证明下调Survivin在动物体内的表达，能够抑制肿瘤生长。本研究发现，沉默GTPBP4基因，p53蛋白表达量增加，而Survivin蛋白表达量降低，并且二者表达定位仍然在细胞核内。表明GTPBP4基因在结直肠癌细胞核可能与p53、Survivin存在相互作用，共同参与结直肠癌的发生发展。

综上所述，GTPBP4基因沉默后，可能对p53抑制作用减弱和影响核糖体蛋白的生物合成触发了RP-Mdm2-p53这一信号通路，使抑癌基因p53被激活，抑制抗凋亡蛋白Survivin表达，最终发挥抑制结肠癌细胞增殖诱导其凋亡的作用。当然这一结论还需结合体内实验来进一步验证。GTPBP4的表达与结肠癌细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移能力密切相关，值得关注的是其与结肠癌患者预后也有一定的相关性。因此，对GTPBP4的研究为今后肿瘤的靶向治疗及预后评估奠定基础。