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miR-21在小鼠神经细胞缺氧缺血损伤中的作用及机制

2019-02-14阎红琳黄文先饶洁袁静萍

山东医药 2019年1期
关键词:神经细胞孵育空白对照

阎红琳,黄文先,饶洁,袁静萍

(武汉大学人民医院,武汉430060)

微小RNA(miRNA)是一类通过与其靶mRNA的3′-UTR互补结合促进mRNA降解或抑制mRNA翻译,从而负性调控靶蛋白表达的小RNA[1]。miRNA在多种人类疾病的病理生理过程中发挥作用。缺血性脑卒中是由脑供血不足引起的急性脑血管病,具有发病率高、致残率高、病死率高的特点[2]。局灶性脑缺血会引起大量神经细胞凋亡。研究表明,继发性神经元死亡是脑梗死的主要原因,导致脑卒中后长期神经功能缺损[3]。脑缺血时神经元损伤的确切机制尚不完全清楚,但最近的研究表明miRNA在缺血性损伤的病理过程中起重要的调节作用[4,5]。miR-21已被证明是一种作用较强的抗凋亡因子,通过靶向宿主促凋亡基因而发挥作用[6,7]。miR-21在大多数实体瘤组织中表达上调[6,8,9],而关于miR-21在缺血缺氧引起的神经损伤中的作用尚鲜有报道。p53蛋白是多种细胞死亡模式中的关键转录调控因子,其控制转录依赖性凋亡和坏死的程序以响应各种信号,包括DNA损伤、氧化应激和缺血[10]。N2a细胞是小鼠来源神经瘤母细胞,多数成神经元样,具有轴突样结构。目前主要在实验室培养该细胞作为体外神经细胞模型,用于研究神经细胞生长、神经毒性、神经退化等。2017年9月~2018年6月,本研究探讨miR-21在神经细胞缺氧缺血损伤中的作用及其机制,为缺血性脑卒中的诊断和治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 小鼠神经母细胞瘤细胞株N2a由本实验室冻存。DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、Earle′s平衡盐溶液购自GIBCO公司;TUNEL细胞凋亡试剂盒购自武汉普健生物科技有限公司;miRNA提取试剂盒购自Qiagen公司;TaqMan miRNA逆转录试剂盒及TaqMan miRNA荧光定量PCR检测试剂盒均购自Applied Biosystems公司;miR-21-mimic、mimic-control均购自上海吉玛有限公司;M-MLV逆转录酶和逆转录引物Odigo(dT)购自invitrogen公司;引物的设计与合成由武汉擎科伟业生物科技有限公司完成;RIPA裂解液和BCA蛋白检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;鼠抗p53购自Santa Cruz公司;鼠抗β-actin 购自Proteintech公司;二抗羊抗鼠IgG购自Santa Cruz公司;硝酸纤维素膜购自Millipore公司。CO2细胞培养箱、OGD专用培养箱购自上海力康仪器有限公司;细胞操作超净工作台购自苏州净化设备有限公司;离心机购自美国Invitrogen公司;荧光显微镜购自日本Nickon公司;PCR仪、荧光定量PCR仪及Western blotting所用的电泳槽、电泳仪、转膜仪均购自美国Bio-Rad公司;Odyssey双色红外激光成像系统购自美国LICOR公司。

1.2 细胞培养及转染 将N2a细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,在37 ℃、5%CO2的培养箱中进行培养,每3天更换1次培养基,进行传代培养。将培养至对数生长期的N2a细胞按6×105/mL接种于6孔板中(1 500 μL/孔)。随机将细胞分为五组:20、40、60 nmol/L转染组及阴性对照组、空白对照组。转染方法:用不含血清培养基的Opti-MEM 250 μL稀释初始浓度为20 μmol/L的miR-21 mimics(加入细胞中的RNA终浓度分别为20、40、60 nmol/L),轻轻混匀,室温孵育5 min;再用不含血清培养基的Opti-MEM 250 μL稀释5 mL lipo2000,轻轻混匀并室温孵育5 min。将以上两种孵育物轻轻混匀,静置20 min,然后加入细胞中,轻轻混匀,放入培养箱中。培养4~6 h后,更换新鲜培养基。以转染mimic-control的细胞作为阴性对照组,以无转染的细胞作为空白对照组。

1.3 神经细胞缺血再灌注损伤方法 将60 nmol/L转染组、阴性对照组和空白对照组采用氧糖剥夺再灌注法进行处理。当细胞密度适当时,以不含葡萄糖的Earle′s平衡盐溶液代替DMEM培养基,将细胞转移至含5% CO2和95% N2的氧糖剥夺模型专用培养箱,在37 ℃下培养2 h,然后将培养基更换为含糖含血清的DMEM培养基,并转移至普通CO2培养箱中复氧24 h,以上过程用于模拟神经元缺血再灌注损伤。

1.4 细胞凋亡指数表达测算 采用TUNEL染色。N2a细胞接种于爬片上,OGD处理后用4%甲醛固定20 min,PBS漂洗3次,每次1 min。然后滴加TUNEL反应混合物,在37 ℃暗盒内避光孵育1 h,DAPI作用5 min,孵育后PBS漂洗3次,每次1 min,封片。标记的样品用荧光显微镜观察,不同组别的细胞各观察3张细胞爬片,每张爬片随机选择6个视野,对凋亡细胞进行计数。凋亡指数=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.5 细胞内miR-21及p53 mRNA检测 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法。用miRNA提取试剂盒从培养的N2a细胞中提取总miRNA,按照TaqMan miRNA逆转录试剂盒及TaqMan miRNA荧光定量PCR检测试剂盒说明将RNA反转录为cDNA进行实时荧光定量PCR。以U6作为内参。mRNA的提取及定量:采用TRIzol试剂提取细胞总RNA,用M-MLV逆转录酶和逆转录引物Odigo(dT)进行逆转录,采用SYBR Premix EX TaqTM试剂盒进行qRT-PCR。以GAPDH作为内参。采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量,实验重复3次。miR-21逆转录引物:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATC-3′;miR-21 PCR扩增上游引物:5′-ACACTCCAGCTGGCTAGCTTATCAGACTGATG-3′、下游引物:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。U6逆转录引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;U6 PCR扩增上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。p53 PCR扩增上游引物:5′-GGAAATCTCACCCCATCCCA-3′、下游引物:5′-CAGTAAGCCAAGATCACGCC-3′;GAPDH PCR扩增上游引物:5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′、下游引物:5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。

1.6 细胞内p53蛋白表达检测 采用Western blotting法。在冰上用RIPA裂解液从细胞中提取总蛋白,BCA法测定蛋白质浓度,随后通过SDS-PAGE凝胶电泳法将蛋白质分离并转移至硝酸纤维素膜上,在5%的脱脂牛奶中37 ℃封闭1 h。用一抗鼠抗p53(1∶500)和鼠抗β-actin(1∶4 000)4 ℃孵育过夜,一抗孵育后TBST溶液洗膜10 min,共2次。用二抗羊抗鼠IgG(1∶1 000)常温孵育1 h,TBST溶液洗膜10 min,共3次。洗涤后,使用LI-COR Odyssey成像系统对信号进行可视化及定量分析。

2 结果

2.1 转染结果 20、40、60 nmol/L转染组及阴性对照组、空白对照组中miR-21相对表达量分别为1.466±0.127、1.729±0.204、2.009±0.182、1.103±0.155、1.004±0.103,与空白对照组、阴性对照组相比,转染组miR-21相对表达量高(P均<0.05),且60 nmol/L转染组miR-21相对表达量最高(P均<0.05)。证明成功将miR-21转染至N2a细胞内。

2.2 miR-21过表达对造模后细胞凋亡指数的影响 转染24 h,60 nmol/L转染组、阴性对照组、空白对照组凋亡指数分别为28.8%±0.7%、44.4%±0.5%、47.2%±0.3%,60 nmol/L转染组凋亡指数低于阴性对照组、空白对照组(P均<0.05)。

2.3 miR-21过表达对造模后细胞内p53 mRNA和蛋白表达的影响 转染24 h,60 nmol/L转染组、阴性对照组、空白对照组p53 mRNA相对表达量分别为0.420±0.236、1.102±0.173、1.026±0.011,p53蛋白相对表达量分别为0.491±0.154、0.937±0.099、1.006±0.021。60 nmol/L转染组p53表达低于阴性对照组、空白对照组(P均<0.05)。

3 讨论

与身体其他组织相比,大脑较易发生缺血性损伤,大约80%的脑卒中患者为缺血性卒中,并且不同于其他组织的即时缺血性损伤,短暂性脑缺血(约10 min)就可以产生神经元损伤。脑缺血后,随着氧气和葡萄糖的逐渐耗尽,细胞所必需的能量依赖过程受到阻碍,从而引发一系列生物学过程,随后,大量细胞由于坏死、凋亡或二者共同作用而死亡[11]。根据以往研究,缺血后继发性神经元死亡是导致脑卒中患者死亡或致残的主要原因,而神经细胞凋亡是继发性脑损伤的重要病理改变,是决定患者神经功能恢复的关键。然而,其涉及的信号通路尚不完全清楚。

近年来越来越多的证据表明,非编码RNA可能参与脑卒中的发病,为脑卒中的病理生理学研究提供了新的思路[12,13]。miR-21位于人类17q23.2号染色体上,广泛表达于哺乳动物细胞,其表达上调与各种实体瘤发病机制相关[6,8,9,14]。有证据显示miR-21在其他器官和不同类型的损伤中有重要作用。Cheng等[15]研究发现过表达miR-21可减轻心肌细胞氧化应激损伤中的细胞凋亡。此外,miR-21在心肌梗死后损伤区域中的心肌成纤维细胞中特异性地表达增加,并且该变化对损伤起改善作用[16]。对于缺血性脑卒中,miR-21是一种很强的抗凋亡和促生存的因子,可下调凋亡相关蛋白的表达。Buller等[17]发现在体外培养的皮层神经元中过表达miR-21可显著抑制缺氧缺糖诱导的细胞凋亡,而抑制内源性miR-21表达则加重了缺氧缺糖后的细胞死亡。Han等[18]报道miR-21可以减少TUNEL阳性神经元的数量,同时,miR-21降低了PTEN的表达水平,显著增加了AKT的磷酸化,在转染miR-21的神经元中,Bcl-2表达增强,而Caspase-3、Caspase-9和Bax表达下调,因此miR-21可以通过激活PTEN-Akt信号通路,下调下游凋亡相关蛋白表达,发挥减少神经元凋亡的作用。本研究以N2a细胞模拟神经细胞,采用氧糖剥夺模型处理N2a细胞,建立体外神经细胞缺氧缺血损伤模型,发现miR-21在氧糖剥夺模型处理后的N2a细胞中表达下调;进一步研究发现在N2a细胞中过表达miR-21可减少缺氧缺血损伤诱导的细胞凋亡。结合以往研究提示miR-21可能在缺血性神经元损伤中发挥保护作用。

p53蛋白是多种细胞死亡信号通路中的关键转录调控因子,主要控制转录依赖的凋亡和坏死程序,如DNA损伤、氧化应激和缺血[10,19]。Pei等[10]报道p53的DNA结合域通过直接结合死亡相关蛋白激酶1的死亡域介导缺血性神经元坏死和凋亡。在细胞核中,p53诱导凋亡前基因如Bax的表达,而在线粒体基质中,p53通过与亲环素D相互作用触发坏死。本课题组曾发现脑缺血后长链非编码RNA母系表达基因3(MEG3)可招募p53进入缺血组织与MEG3结合形成MEG3-p53复合体,并介导缺血性神经元死亡[20]。在本研究中,p53mRNA和蛋白在氧糖剥夺模型处理后的N2a细胞中均表达上调,提示p53可能参与了N2a细胞的缺血性损伤。

miRNA通过结合mRNA的3′UTRs来抑制其靶基因。据报道,一些miRNA参与p53通路,或受p53调控,或直接抑制p53或其下游蛋白的表达,这表明miRNA在p53信号通路中的重要性[20]。在多种肿瘤细胞中均存在p53的表达下调与miR-21表达上调。有研究显示miR-21可抑制p53通路中多个基因的表达。在乳腺癌细胞中,抑制miR-21的表达可诱导p53调控的多个基因的表达[21]。miR-21在胶质母细胞瘤细胞中表达下调,可激活p63和p53通路,导致细胞周期阻滞,促进细胞凋亡[22]。本研究在N2a细胞中过表达不同浓度的miR-21后,p53mRNA和蛋白质会随着miR-21浓度的升高而逐渐减少,提示miR-21可负向调控N2a细胞中p53的表达,这与众多肿瘤研究中二者的关系基本一致。在肿瘤研究中,miR-21的上调、p53的下调多与肿瘤细胞的增殖或凋亡有关,而本研究发现,miR-21抑制p53表达可显著减少氧糖剥夺模型诱导的N2a细胞凋亡,提示miR-21抑制p53的表达在神经细胞缺氧缺血损伤中发挥一定作用。

综上所述,在体外培养的神经细胞N2a中,miR-21过表达对神经缺氧缺血损伤细胞有保护作用,该作用可能与其负调控N2a细胞中p53表达有关。本研究为神经细胞缺氧缺血损伤中的作用机制提供理论基础,为缺血性脑卒中的诊断和治疗提供新的靶点。

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