分子生物学技术鉴别多结节肝癌克隆起源的研究进展

赵媛，罗洪林，刘军杰，陈苗，黎乐群

(广西医科大学附属肿瘤医院，南宁530021)

肝细胞癌(HCC)是目前世界第六大恶性肿瘤，在男性和女性中的致死率分别居第1位、第6位[1]。在我国，每年新发HCC病例数约占全球的55%，其中12%～19%的HCC患者为多结节HCC患者[2]。多结节HCC的起源分为多中心起源和单中心起源。多中心起源HCC各结节从彼此独立的原发肿瘤灶克隆而来；而单中心起源HCC各结节内具有相同克隆起源的肿瘤细胞，即肝内转移[3]。由于两种不同起源的多结节HCC肿瘤生物学特性有较大差异，所选择的治疗措施和预后效果也各不相同。因此，如何精准的区分多结节HCC的起源成为首要任务[4]。近年来，在应用分子生物学技术鉴别多结节HCC克隆起源上取得了较大进展，本文对目前已报道的分子生物学检测方法进行综述。

1 多结节HCC的病理学特征

根据临床病理学特征，结节型HCC可细分为三型：单结节(SN)型、单结节伴结节外生长(SNEG)型及多结节融合(CM)型。通常将SNEG称为多结节HCC，CM型则不划分入多结节HCC内[5]。应用组织病理学特征来确定多结节HCC的起源是最简单的方法，即明确各肿瘤结节是单克隆来源还是多克隆来源，对二者进行区分[6]。

多中心HCC各结节的组织学分级和特征不同，其组织病理学特征包括：①高分化的早期HCC；②高度和中度分化并存的早期HCC(高度分化的HCC其边缘中度分化[7])或低分化晚期HCC；③在分化程度和异型性上明显不同的组织学分级[8]。

肝内转移性HCC肿瘤结节均为晚期肿瘤分级的进展性病变，其特征为：①肿瘤明显从门静脉血栓中生长；②肿瘤周围有大的主要肿瘤，有多个卫星结节；③主要肿瘤附近的小孤立肿瘤，其组织学上与主要肿瘤相似或较少分化[8]。

按照结节在肝炎病毒感染导致肝硬化的肝脏中发生的时间，可将多中心HCC划分为同步发生和异时发生两种[9]。同步多中心HCC的病理学特征包括：分化良好的结节和(或)分化良好的癌性结节中含有中度分化的肿瘤组织，这表明病变是在原位起源并增殖的，该病例被评估为同步多中心的HCC。在HCC中发现有腺瘤样增生或者发现HCC前体病变的非典型腺瘤样增生，此时考虑为异时多中心HCC[10]。

通过病理学特点进行区分仅适用于分化良好的肿瘤细胞，当肿瘤细胞分化程度低并且数量少时，应用病理学来分类则比较困难。因此，应用分子生物学检测方法来补充病理学诊断非常必要[11]。

2 鉴别多结节肝癌克隆起源的分子生物学技术

2.1 乙型肝炎病毒DNA整合方式 HCC的发生与慢性肝炎和病毒感染引起的肝硬化紧密相关。其中，乙型肝炎病毒引起的肝硬化是导致HCC发生最常见的原因之一。乙型肝炎病毒是一种DNA病毒，在大多数由慢性乙型肝炎病毒携带者发展为肝细胞癌的患者中，病毒基因组被克隆整合入宿主染色体DNA。在已经进行过的分子研究中发现，病毒整合入宿主基因组导致新的融合转录物和(或)局部基因组不稳定，导致宿主和(或)病毒基因组序列的二级缺失、重排、重复或易位[12]。Ng等[13]研究显示，应用Southern印迹法对多结节HCC中HBV整合情况进行分析，其中多中心起源者结节之间Southern印迹条带模式有差异，观察到不同的HBV整合模式，证明结节的不同克隆性。而单中心者在相应的结节中显示出几乎完全相同的条带模式，揭示了相似或相同的克隆起源。但是该方法来区分单中心起源和多中心起源的局限性在于仅应用于被乙型肝炎病毒感染者或女性患者[14]。

2.2 p53基因突变类型分析 p53是最频繁突变的人类抑癌基因之一，大多数突变位于密码子249的一个核苷酸对处[15]。p53基因突变是导致HCC发生的主要因素，因为p53基因突变会影响p53蛋白在HCC中的表达.p53蛋白在HCC中起重要作用，其高表达可能表明存在肿瘤转移和门静脉侵袭，并且可以在晚期肿瘤中明显观察到[16]。Oda等[17]研究表明，在大部分多结节HCC中，至少在一个结节中显示基因突变。HCC中存在三种不同的p53突变模式，其中模式A-B和A-0分别表示结节之间p53突变存在差异，结节内的细胞克隆来源不同。因此，有显示为这两种遗传模式的病例可以被诊断为多中心起源。而在A-A型病例中显示出相同遗传异常的结节很可能来源于相同的克隆，说明此时多结节HCC为肝内转移导致。p53突变的分析在许多缺乏p53突变的HCC患者中受到阻碍，常与其他方法联合应用[18]。

2.3 甲胎蛋白(AFP)基因低甲基化分析 AFP由胚胎肝细胞合成[19]，在正常肝细胞中不表达，但在HCC细胞中特异性表达，70%～80%的HCC组织中可检测到其重新表达，可作为诊断HCC的生物标志物[20]。HCC组织中AFP基因的表达有助于血清AFP水平的升高。Peng等[21]研究表明AFP基因的5'区域低甲基化与肝细胞癌中的AFP基因再表达相关，并且通过检测HCC结节中AFP mRNA有助于区分单中心和多中心HCC，在AFP升高的7例多中心HCC中，有5例只在卫星结节检测到AFP mRNA，主瘤内均检测不到AFP mRNA。7例带有卫星结节的单中心HCC,其中在4例AFP水平升高相关的HCC所有肿瘤结节中检测到AFP mRNA，但在其余3个AFP水平正常病例中未检测到AFP mRNA表达。Wang等[22]也有研究表明，单中心起源组中的AFP水平明显高于多中心起源组。

2.4 线粒体DNA(mtDNA)D-环区(D-Loop)突变分析 mtDNA包含1个独特的非编码D-Loop，该区域控制着转录和mtDNA的复制[23]。mtDNA的D-Loop区突变发生在大多数癌症中，该区的突变也是确定多结节HCC的细胞克隆起源的有用标记。通过对各结节肿瘤组织和门静脉肿瘤栓子中mtDNA D-Loop区的序列检测，显示该区域具有相同的变异，证明组织来源于相同的原发性肿瘤结节，即可确定多结节HCC为单中心来源。在这种情况下，mtDNA D-Loop区序列的测定对于区分MO和IM是有效的、可行的，即可以确定多结节HCC的细胞克隆起源[24]。但mtDNA D-loop区突变可能发生在HCC发展过程中的任何阶段，难以确定每个结节的细胞克隆来源[25]。

2.5 比较基因组杂交(CGH)技术 CGH技术是一种具有高度特异性的分子细胞遗传学方法，在整个基因组中进行DNA序列增益和损失的位置识别[26]。其为HCC的细胞遗传学及多中心生长与转移性扩散的提供了新的见解。Wilkens等[27]研究表明，某些染色体的改变在单中心起源和多中心起源的各个肿瘤结节内并无明显差异，而特定染色体内的畸变模式在此两种起源的多结节HCC中则有明显不同。利用cDNA微阵列对单中心起源和多中心起源的多结节HCC进行分析从而达到区分目的，发现原发性肿瘤相同的不同转移瘤中，基因表达的总体模式是相似的，意味着转移性进展是从原发性肿瘤中开始的。而多中心起源的基因表达模式则各不相同[28]，CGH与先前用于区分多结节HCC肝内转移与多中心生长的其他方法相比具有明显优势，但CGH在实施上有难度，具有一定的局限性[27]。

2.6 蛋白组学技术 应用蛋白组学技术，可观察到HCC患者组织中某些已被用为鉴定HCC的潜在标志物蛋白质表达上调，如过氧化物酶3、骨桥蛋白、AFP等[29]。分析两种不同起源多结节HCC的蛋白质组表达谱，来鉴定不同蛋白分子在单中心起源和多中心起源中起到的作用，同时为筛选蛋白质标记物以区分HCC起源和建立诊断模型提供基础。也可通过蛋白组学来筛选不同细胞克隆起源的多结节HCC的差异蛋白表达谱，可在多种因素的影响下鉴定肿瘤细胞的蛋白质组变化，并寻找直接参与肿瘤的发生、进展、侵袭、转移的关键蛋白质分子[2]。但不同蛋白质生物标记物的灵敏性与特异性各不相同，利用蛋白质标记物的组合来创建更灵敏的生物标记物组可以改善检测性能[29]。与基因组分析不同，蛋白组学分析直接由蛋白质表达水平决定，这能更好地检测细胞功能。因此，蛋白质谱分析是确定HCC发生、进展和化疗耐药性潜在分子机制的首选方法。

2.7 下一代测序技术 目前有关癌症的基因组研究主要集中在编码区的突变，而其他类型的突变如非编码区的碱基置换或插入以及结构变异通常被忽略，因其对癌症发展的影响难以评估和解释。评估编码区突变有害性的一种方法是检查这些基因组改变及转录结果，应用下一代测序能够通过全基因组测序(WGS)、外显子组测序(WES)和转录组测序(RNA-Seq)等技术大规模全面分析癌症基因组[4]，以确定不同肿瘤部位或多个肿瘤结节中的遗传异质性及其可能具有的功能，为治疗及预后提供建议。

Shi等[30]对1名同时患有2例同时性多结节HCC(HCC-A、HCC-B)、1例肝内胆管癌(ICC)和2例复发性HCC的患者进行多区域WES，以了解各肿瘤的克隆性和异质性。3例原发肿瘤在突变和拷贝数变异中几乎无重叠，各肿瘤多区域测序数据显示不同的肿瘤内异质性(HCC-A中21.6%、HCC-B中20.4%、ICC中53.2%)，则2例同时性多结节HCC为同时性多中心HCC。2例复发性肿瘤的突变特征显示与HCC-A明显相似(分别为86.7%和86.6%)，表明其起源极有可能同为HCC-A。结果表明，通过WES可以确定同步性HCC克隆起源是否相同，甚至可以确定复发肿瘤起源于何种原发肿瘤，对鉴别多结节HCC的克隆起源有重要价值。

WGS可在单细胞水平上确定多结节HCC的克隆起源，为癌症生物多样性提供新的见解[31]。通过WGS和RNA-Seq更深入地了解癌症基因组中的基因组突变和转录异常之间的关系，二者综合分析是解释癌症基因组和了解癌症生物学潜在基因组改变的关键途径。但WGS过程复杂，费用较昂贵，超过了绝大多数单位可接受的程度，所以暂时不能得到广泛推广使用。

WGS和WES均已用于大规模检测单核苷酸变异。虽然WGS可以检测整个癌症基因组中的全部变异谱、拷贝数变异和结构变异体，其在1%～2%编码功能蛋白基因组中检测单核苷酸变异和插入缺失时更具成本效益。外显子组织中单核苷酸变异是许多疾病的病因，因此WES已广泛应用于研究和临床[32]。

利用分子生物学技术确定多结节HCC的克隆起源，从实用方面来说，若想确定HCC是多中心起源还是单中心起源，需对每个结节进行检测。因结节之间可能存在异质性，只对一个结节的克隆起源进行评估无法确定其他结节的起源。这必然加大检测的复杂程度。应考虑联合应用已有的分子生物学鉴别手段，以弥补单一检测方法存在的缺陷，从而达到最佳的鉴别效果。另外，实现精准鉴别多结节HCC克隆起源，需不断探索发现新的分子生物学标记物。