Aurora-B介导NPM1蛋白磷酸化促进骨肉瘤细胞恶性表型的体外研究

皮闻森，刘家明，黄山虎，刘志礼

骨肉瘤（OS）是最常见的原发性恶性骨肿瘤，多发于儿童和青少年。虽然新辅助化疗的出现使得原发患者的生存率有所提高（55%～80%），但发生肺部转移的患者5年生存率仍低于20%，其中肺转移是OS患者的主要死亡原因［1］。因此，阐明OS转移的分子机制，可为OS转移的防治提供有效的策略甚至靶点，对提高患者生存率非常必要。激光激酶-B（Aurora-B，又称AURKB），是一种在多种恶性肿瘤中高表达的癌基因，与肿瘤发生、发展及转移密切相关［2］。本研究采用骨肉瘤143B、U2-OS细胞株，结合生物信息学探讨沉默Aurora-B介导NPM1蛋白磷酸化水平改变对骨肉瘤细胞迁移、侵袭和增殖能力的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 人骨肉瘤细胞143B购自中国科学院上海细胞库，Aurora-B沉默慢病毒（LV/ShAurora-B）、NPM1过表达慢病毒（LV/NPM1）和阴性对照慢病毒（LV/negative）购自上海吉凯基因。DMEM培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司。总蛋白提取试剂盒（BB-3101）购自BestBio公司。凝胶制备试剂盒（AR018）购自于BOSTER公司。Aurora-B、NPM1（nucleophosmin1）和磷酸化NPM1ser125单克隆抗体（兔抗人）购自美国Abcam公司。β-actin单克隆抗体（鼠抗人）、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔多克隆抗体和HRP标记山羊抗鼠多克隆抗体购自北京中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学预测 通过癌症基因组图谱（TCGA）数据库（https://cancergenome.nih.gov/）查找NPM1在肉瘤中的表达水平以及预后情况；通过KinasePhos数据库（http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/）预测NPM1的磷酸化情况，预测AURKB与NPM1之间的关系。

1.2.2 细胞培养和慢病毒转染 人骨肉瘤U2-OS细胞和143B细胞株用含15%胎牛血清的DMEM完全培养液培养，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。细胞分为LV/ShAurora-B组、NC（LV/negative）组、LV/ShAurora-B与LV/NPM1共转染组。依据吉凯公司提供的转染指南，分别转染143B与U2-OS细胞，继续培养72 h以后，用于后续实验。

1.2.3 Western blot检测Aurora-B、NPM1和pNPM1ser125蛋白表达 转染后消化、收集Lv/ShAurora-B组和NC组的细胞，提取细胞蛋白后应用BCA蛋白定量法测定蛋白含量。SDSPAGE分离蛋白，于冰上湿转，转膜后置于含5%BSA的TBST中封闭2 h，加入Aurora-B（1∶5 000），NPM1（1∶2 000），磷酸化NPM1ser125（1∶2 000）和β-actin（1∶2 000）一抗，4℃孵育过夜，TBST振荡洗膜10 min×3次，以封闭液稀释的HRP标记的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次。于暗室中加入ECL显色液曝光，采用Image J进行灰度分析。

1.2.4 Wound healing法检测细胞迁移能力 取对数生长期的各组细胞，胰蛋白酶消化，以5×105个/mL细胞密度接种于6孔培养板，500µL/孔，常规孵育，直至细胞铺满，形成细胞单层。用200µL/移液器枪头沿培养板底部呈“一”字型划痕单层培养细胞，显微镜下（×200）观察初始划痕区并照相。吸取原有培养液，PBS清洗2次，去除被刮除的悬浮细胞，更换无血清的DMEM培养液，继续培养24 h并拍照（×200）。Image J 1.47 H软件计算细胞迁徙率［迁移率=（0 h的平均宽度-24 h的平均宽度）/0 h的平均宽度］。实验平行做3次。

1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖能力 将转染后的U2-OS和143B细胞（3 000个/孔）分别接种在96孔培养板中培养。48 h后每孔加入10µL的CCK-8溶液，并在37℃下再温育2 h。用酶标仪测量在450 nm处光密度（OD）值。实验平行做3次。

1.2.6 Transwell invasion法检测细胞侵袭能力 将转染48 h的各组U2-OS、143B细胞消化，用无血清培养基重悬，调整细胞密度为1×105个/mL，分别取150µL细胞悬液接种于小室内，将小室放入含10%FBS的培养液（600µL/孔）中继续培养24 h。取出小室，吸弃上室液体，PBS漂洗2次，95%乙醇固定10 min，用棉签擦净小室膜上侧未迁移的细胞。4 g/L结晶紫染色20 min，PBS漂洗2次。倒置显微镜下（×200）随机读取10个视野，观察细胞穿膜情况并拍照。Image J 1.47 H软件计算穿膜细胞数。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。符合正态分布的计量数据以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学结果 通过TCGA数据库发现，NPM1在肉瘤中高表达（图1A），NPM1高表达的骨肉瘤患者预后较差（图1B）；通过KinasePhos数据库库发现，NPM1存在丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点（图1C），而Aurora-B是丝氨酸和苏氨酸激酶，因此Aurora-B与NPM1之间可能存在相互作用。

2.2 下调Aurora-B后检测Aurora-B、NPM1和pNPM1ser125蛋白的表达情况 2种细胞中，与NC组相比，LV/ShAurora-B组Aurora-B和pNPM1ser125蛋白水平降低（P＜0.05），而NPM1蛋白的变化差异无统计学意义，见表1、图2。

Tab.1 Expressions of Aurora-B,NPM1 and pNPM1ser125 detected by Western blot assay表1 Western blot检测Aurora-B、NPM1和pNPM1ser125蛋白的表达 （n=3，±s）

Tab.1 Expressions of Aurora-B,NPM1 and pNPM1ser125 detected by Western blot assay表1 Western blot检测Aurora-B、NPM1和pNPM1ser125蛋白的表达 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01

组别U2-OS细胞Aurora-B NPM1pNPM1ser125 NC组LV/ShAurora-B组t 0.984±0.077 0.051±0.006 20.924＊＊0.714±0.012 0.750±0.034 1.729 0.624±0.012 0.015±0.001 87.598＊＊组别NC组LV/ShAurora-B组t 143B细胞Aurora-B 0.874±0.031 0.098±0.013 39.984＊＊NPM1 0.654±0.010 0.678±0.019 1.936 pNPM1ser125 0.651±0.028 0.243±0.012 23.198＊＊

2.3 各组骨肉瘤细胞的迁移情况比较 LV/ShAurora-B组迁移率均低于NC组（P＜0.05），且共转染组中下调Aurora-B的迁移抑制被部分恢复（P＜0.05），见表2。

Fig.1 The results of bioinformatics analysis图1 生物信息学分析结果

Fig.2 Expressions of Aurora-B,NPM1 and pNPM1ser125 detected by Western blot assay图2 Western blot检测Aurora-B、NPM1和pNPM1ser125蛋白的表达

Tab.2 The cell migration ability detected by Wound healing assay in OS cells表2 Wound healing实验检测骨肉瘤细胞的迁徙能力（n=3，%，±s）

Tab.2 The cell migration ability detected by Wound healing assay in OS cells表2 Wound healing实验检测骨肉瘤细胞的迁徙能力（n=3，%，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与NC组比较，b与LV/ShAurora-B组比较，P＜0.05；表3、4同

组别NC组LV/ShAurora-B组共转染组F U2-OS细胞50.7±10.4 20.2±5.6a 35.1±4.7ab 12.983＊＊143B细胞61.5±12.8 23.0±9.8a 42.5±2.6ab 12.448＊

2.4 各组骨肉瘤细胞的增殖情况比较 143B和U2-OS细胞中，LV/ShAurora-B组增殖能力均低于NC组（P＜0.05），且LV/ShAurora-B+LV/NPM1共转染组能部分恢复下调Aurora-B的增殖抑制（P＜0.05），见表3。

Tab.3 The proliferation ability detected by CCK-8 assay in OS cells表3 CCK-8实验检测骨肉瘤细胞增殖能力（n=3，OD值，±s）

Tab.3 The proliferation ability detected by CCK-8 assay in OS cells表3 CCK-8实验检测骨肉瘤细胞增殖能力（n=3，OD值，±s）

组别NC组LV/ShAurora-B组共转染组F U2-OS细胞0.843±0.060 0.413±0.035a 0.633±0.021ab 78.509＊＊143B细胞1.073±0.076 0.493±0.025a 0.757±0.025ab 106.906＊＊

2.5 各组骨肉瘤细胞的侵袭能力比较 在2种细胞中，LV/ShAurora-B组侵袭细胞数均低于NC组（P＜0.05），且LV/ShAurora-B+LV/NPM1共转染组能部分恢复下调Aurora-B的侵袭能力抑制（P＜0.05），见表4、图4。

Tab.4 The invasion ability detected by Tanswell invasion assay in OS cells表4 Transwell invasion实验检测骨肉瘤细胞的侵袭能力（n=3，个/视野，±s）

Tab.4 The invasion ability detected by Tanswell invasion assay in OS cells表4 Transwell invasion实验检测骨肉瘤细胞的侵袭能力（n=3，个/视野，±s）

组别NC组LV/ShAurora-B组共转染组F U2-OS细胞155.000±14.526 82.333±22.745a 134.000±11.523a 14.613＊143B细胞189.330±15.011 57.667±16.010a 120.667±13.051ab 63.997＊＊

Fig.3 The cell migration ability detected by Wound healing assay in OS cells（×200）图3 Wound healing实验检测骨肉瘤细胞的迁徙能力（×200）

Fig.4 The cell invasion ability detected by Tanswell invasion assay in OS cells(crystal violet staining,× 200）图4 Transwell invasion实验检测骨肉瘤细胞的侵袭能力（结晶紫染色，×200）

3 讨论

Aurora-B是Aurora家族3个成员之一，其功能是参与调节中心体和微管的功能、保证染色体的精确分离和胞浆的有效分离、着丝粒的复制、双极纺锤体的形成以及监测纺锤体检测点的忠实性等［3］。它们通常在G2/M期达到高峰，是调节细胞周期由G2期向M期进展的关键因子。Aurora-B基因定位在17p13，处在易位、缺失或扩增活跃的染色体区段，意味着它们具有天然的不稳定性。有研究显示，Aurora-B通过激活蛋白激酶B（protein kinase B,AKt）/哺乳动物雷帕霉素靶点（mammalian target of rapamycin,mTOR）信号传导途径来促进淋巴瘤细胞存活和增殖［4］。本课题组前期研究表明，Aurora-B通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/AKt/核转录因子kappa β（nuclear factor kappa beta，NF-κβ）信号通路促进骨肉瘤恶性表型［5］。本次研究发现，PI3K/AKt抑制并不能完全逆转Aurora-B介导的骨肉瘤侵袭转移，提示Aurora-B所介导的骨肉瘤侵袭转移可能还涉及其他分子机制。因此，进一步探讨Aurora-B介导骨肉瘤侵袭转移的分子机制显得十分必要和重要。

NPM1是一种具有高活性的核仁蛋白，在核糖体蛋白组装、染色质重塑以及DNA修复、复制和转录中发挥积极作用［6-8］。磷酸化、乙酰化和泛素化等翻译后修饰可使生成的NPM1定位于不同的亚细胞区域，从而行使不同的功能。越来越多的证据表明，NPM1是一种直接参与癌症发病机制的核仁蛋白。在包括前列腺癌、血液肿瘤和高级浆液性卵巢腺癌等多种恶性肿瘤中发现，NPM1的高表达且与肿瘤进展和抗药性有关［9］。本研究通过生物信息数据库查找，显示NPM1在肉瘤中高表达以及NPM1高表达的患者预后较差，并且Aurora-B与NPM1之间可能存在磷酸化作用。以此为基础，通过体外实验，进一步证实了下调Aurora-B后磷酸化NPM1ser125蛋白的表达降低，而非磷酸化NPM1蛋白的表达不变。以上结果表明Aurora-B能够介导NPM1的磷酸化。然而，Aurora-B介导的NPM1蛋白磷酸化并不一定对骨肉瘤细胞恶性表型产生效应，为此，进一步行体外恶性表型的验证显示，沉默Aurora-B后骨肉瘤的侵袭、增殖和迁移能力均受到抑制，且沉默Aurora-B后同时过表达NPM1发现，下调Aurora-B对骨肉瘤侵袭、转移和增殖的抑制作用被部分缓解，这证实了Aurora-B能够通过介导NPM1蛋白磷酸化促进骨肉瘤细胞恶性表型，但是NPM1介导骨肉瘤恶性表型改变的具体分子机制仍未可知。

Chen等［10］研究显示，NPM1通过影响Akt活性，从而在乳腺癌中发挥抗凋亡作用。另外，研究证实RNA干扰（RNAi）沉默NPM1基因能显著降低前列腺癌细胞中细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）的磷酸化水平［11］。ERK1/2的磷酸化可促使与NF-κβ相结合的Iκβα发生降解，使定位于胞浆的NF-κβ转移至核内［12-13］；NF-κβ的核内移位可促使基质金属蛋白酶-2（matrix metalloprotein-2，MMP-2）、MMP-9等与肿瘤转移相关的基因表达上调，促进包括骨肉瘤在内的多种肿瘤的细胞侵袭和转移［14-15］。因此，在骨肉瘤细胞中，Aurora-B是否通过NPM1/ERK/NF-κβ信号轴促进骨肉瘤恶性表型亦是后续有意义的研究方向。

综上所述，Aurora-B通过介导NPM1蛋白磷酸化促进骨肉瘤细胞恶性表型。但本研究仅做了Aurora-B沉默，且缺乏体内实验证实这一结论。另外，NPM1介导骨肉瘤恶性表型改变的具体分子机制亦有待后续进一步研究。