CHOP疗法对T细胞淋巴瘤Hut 78和HH细胞环状RNA circ_001569及其下游蛋白表达的影响

康庆伟，阎姝

非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）可以根据其起源分为T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤。对于多数T细胞淋巴瘤患者，CHOP疗法［环磷酰胺（Cyclophosphamide）+羟基柔红霉素（Hydroxydaunorubicin）+长春新碱（Oncovin）+泼尼松（Prednisone）］是常用的治疗手段之一［1-2］。环状RNA（circRNAs）是广泛存在于真核细胞中的一种非编码RNA。研究表明，circRNAs在肿瘤的病理过程中起到了一定的调节作用，并且有可能成为肿瘤早期诊断的重要标志物［3］。circRNA_001569 是circRNAs的一种，其在结直肠癌中表达水平增高，并且可以通过反向调节微小RNA（miR）-145，进而促进E2F转录因子5（E2F transcription factor 5，E2F5）、BAG家族分子伴侣蛋白调节因子4（BAG family molecular chaperone regulator 4,BAG4）和类甲酸蛋白2（Formin-like protein 2，FMNL2）基因的表达［4］。CHOP疗法应用过程中常引起白细胞降低、贫血、出血风险增高、脱发等不良反应［5］，深入研究其作用机制，有助于进一步了解淋巴瘤的发病机制和病理过程。本研究采用CHOP疗法中的4种治疗药物处理T细胞淋巴瘤Hut78和HH细胞系，检测其对环状RNA circRNA_001569及其下游miRNA和相关基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Hut78细胞（TIB-161™）、HH细胞（CRL-2105™）购自美国ATCC®，胎牛血清、1640培养基购自美国Hyclone公司；RNAiso Plus（货号：9108）、MicroRNA first-strand synthesis and miRNA quantitation kits（货号：638315）购自 TaKaRa公司；ProtoScript®Ⅱ Reverse Transcriptase（货号：M0368S）购自英国New England Biolabs；PCR试剂（货号：MasterMix-LR）购自加拿大ABM公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、细胞裂解液（货号：P0013）购自杭州碧云天生物技术有限公司；Immun-Blot®PVDF膜（货号：1620177）购自美国Bio-Rad；细胞增殖检测试剂盒（货号：G3582）购自美国Promega；兔源BAG4多克隆抗体（货号：ab134051）、兔源β-actin多克隆抗体（货号：ab8227）、鼠抗兔二抗（货号：ab99696）购自美国Abcam；环磷酰胺（货号：C126044-500 mg）、羟基柔红霉素（货号：D107159-100 mg）、长春新碱（货号：V107236-100 mg）、泼尼松（货号：P116562-1 g）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 细胞培养 Hut78细胞和HH细胞在37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中采用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的1640培养基进行培养，每2 d换液1次。

1.3 细胞分组及处理 Hut78细胞和HH细胞均设对照组、环磷酰胺组（1µmol/L）、羟基柔红霉素组（0.2µmol/L）、长春新碱组（1µmol/L）、泼尼松组（1µmol/L），各组加药处理24 h后，收集细胞进行检测。

1.4 细胞增殖实验 采用CellTiter 96®AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay（MTS）试剂盒检测Hut78细胞和HH细胞的增殖情况，具体操作按照试剂盒说明书进行，每组设6个重复孔。

1.5 RNA提取及逆转录 按照RNAiso Plus试剂说明书提取总RNA。RNA样品采用Nanodrop 2000检测A260/A280，确定RNA纯度及浓度。采用NEB ProtoScript®ⅡReverse Transcriptase进行逆转录，具体操作按照说明书进行。miR-145茎环法逆转录引物序列为：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACCAT-3′。

1.6 实时定量PCR 按照PCR试剂盒说明书，在ABI 7500 fast仪器上进行实时定量PCR操作，PCR反应体系为2×SYBR Green Mix 10µL，上下游引物各0.4µL，cDNA 2µL，ddH2O 7.2µL。反应条件为：50℃ 2 min；95℃ 5 min；95℃15 s，60 ℃ 40 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算基因mRNA表达水平，每个样品设3个复孔。实时定量PCR采用的引物序列见表1。

Tab.1 Primer sequence of qPCR表1 实时定量PCR引物序列

1.7 Western blot检测miR-145下游分子BAG4的表达 将羟基柔红霉素组和长春新碱组细胞用PBS液清洗3次，1 000 r/min离心15 min收集细胞，IP细胞裂解液裂解细胞后，加入上样缓冲液煮沸10 min，12 000 r/min离心20 min后取上清，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转法将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭过夜，次日TBST洗膜3次，BAG4（1∶2 000）、β-actin（1∶2 000）一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min。分别用鼠抗兔二抗4℃孵育过夜后，TBST洗膜3次，每次10 min，最后ECL化学发光检测，采用UVITEC化学发光成像分析系统Alliance MINI HD6进行拍照记录并计算各组蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法 采用SPSS 19.0对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖实验结果 环磷酰胺、羟基柔红霉素、长春新碱和泼尼松均可显著抑制Hut78细胞和HH细胞的增殖（P＜0.05），见图1。

Fig.1 The results of cell proliferation in different groups图1 各组细胞增殖实验结果

2.2 各组细胞circRNA_001569和miR-145表达变化 与对照组相比，羟基柔红霉素和长春新碱可抑制Hut78细胞和HH细胞中circRNA_001569的表达，促进miR-145的表达（P＜0.05）；而环磷酰胺组和泼尼松组与对照组相比，circRNA_001569和miR-145表达差异无统计学意义（P＞0.05），见图2、3。

Fig.2 Changes of circRNA_001569 expression levels in different groups图2 各组circRNA_001569表达变化

Fig.3 Changes of miR-145 expression levels in different groups图3 各组miR-145表达变化

2.3 羟基柔红霉素和长春新碱可以降低Hut78细胞和HH细胞中BAG4表达 为了进一步探索羟基柔红霉素和长春新碱的抗肿瘤机制，本研究从基因和蛋白水平均证实羟基柔红霉素、长春新碱均可降低Hut78和HH细胞系中BAG4的表达。见图4、5。

Fig.4 Hydroxydaunorubicin and oncovin inhibited the mRNA expression level of BAG4 in Hut78 and HH cells图4 羟基柔红霉素、长春新碱均可抑制Hut78细胞和HH细胞中BAG4 mRNA的表达

3 讨论

Fig.5 Hydroxydaunorubicin and oncovin inhibited the protein expression level of BAG4 in Hut78 and HH cells图5 羟基柔红霉素、长春新碱可以显著抑制Hut78细胞和HH细胞中BAG4的蛋白表达水平

在非霍奇金淋巴瘤的治疗中，CHOP作为一种常用的化疗方法得到了广泛的使用，临床上取得了一定的疗效，但是其不良反应较多。为了增强其疗效，减轻不良反应，改善患者的生存质量，临床中常采用CHOP联合其他药物来治疗T细胞淋巴瘤，如利妥昔单抗等。circRNAs是一个闭合、连续的环状结构，不具有线性RNA拥有的3′和5′端的尾部结构，相比线性RNA更为稳定［6］，可以起到对miRNA的“海绵”吸附作用，进而调节基因表达［7］。并且其有可能成为肿瘤的早期诊断的标志物，具有重要的临床意义［8-10］。既往多项研究发现，环状RNA CDR1as与肝癌微血管侵袭有关，是肝癌和胆管癌发生的生物标志物［11-13］。Chen等［14］发现在胃癌组织中Circ-PVT1表达异常增高，可能与其对miR-125产生吸附作用，进而促进胃癌细胞增殖有关。在肝癌细胞中，circ_0005075和circ_0001649在肿瘤组织和癌旁组织中存在差异性表达，具有成为生物标志物的潜力［12，15］。在结直肠癌中，circRNA_001569表达上调，通过其对miRNA的“海绵”吸附作用，特异性降低miR-145的表达，并且解除miR-145对E2F5、BAG4和FMNL2的抑制［4］。但在淋巴瘤中鲜见有关环状RNA circRNA_001569和miR-145的相关研究报道。目前对于环状RNA的研究大多是有关环状RNA对肿瘤增殖及相关信号通路等方面的影响，对于药物药理机制的研究较少。而本研究发现，羟基柔红霉素、长春新碱可以显著抑制Hut78细胞和HH细胞中circRNA_001569的表达，说明在抗肿瘤药物的作用下，某些环状RNA的表达发生了改变，其抗肿瘤作用有可能是通过环状RNA的调节而产生。

BAG4也被称为死亡结构域沉默子（silencer of death domains，SODD），是BAG1相关蛋白家族的一员，在细胞核和细胞质中均有表达。Yi等［16］证实BAG4可增加GC细胞的增殖和侵袭，可能是胃癌的治疗靶点。而缺失BAG4将会导致对于铂类化疗药物的抵抗［17］。在急性淋巴细胞白血病中，BAG4表达水平升高，并且参与了肿瘤细胞的凋亡以及化疗药物耐药性抵抗作用［18］。本研究表明，羟基柔红霉素、长春新碱不但可以对Hut78细胞和HH细胞中circRNA_001569的表达产生一定的调控作用，同时可以显著抑制其下游BAG4的蛋白表达水平。提示环状RNA circRNA_001569可能在T细胞非霍奇淋巴瘤中起到了一定的调控作用，有必要进一步深入研究