P-糖蛋白过表达对INS-1和大鼠胰岛β细胞分化的影响

陈亚，高雅莉，李代清

P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）又称为多重耐药蛋白1（multidrug resistance1，MDR1），是一个分子质量约170 ku，利用三磷酸腺苷（ATP）水解产生的能量将外来物质排出细胞外的膜蛋白［1］。人类P-gp由abcb1单基因调控，啮齿类动物由abcb1a和abcb1b双基因调控［2］。本研究前期实验表明大鼠胰岛P-gp的表达主要是由abcb1b调控［3］。多数研究者认为2型糖尿病的主要病理机制是胰岛β细胞数量的减少和功能的衰竭，而美国Accili团队提出糖尿病中β细胞的衰竭与其去分化有关［4］。虽然P-gp研究的热点主要是与其外排泵相关的肿瘤耐药机制，但也有文献报道P-gp的表达影响细胞的分化［5］。P-gp与胰岛β细胞的分化有无联系尚不清楚。本研究通过构建INS-1细胞和SD大鼠P-gp过表达模型，探究P-gp过表达后对β细胞分化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞、腺病毒及动物 大鼠胰岛β细胞系INS-1购于中国科学院北京协和细胞库。重组腺病毒颗粒由上海凯基基因构建。野生型SD大鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司。转基因大鼠（Ins2-abcb1b）由南京生物医药研究院造模，所有动物均为雄性，10～12周，体质量250～300 g。

1.1.2 试剂 RPMI-1640购于美国GIBCO公司；澳洲胎牛血清购于依科赛生物公司；胶原酶Ⅴ、β巯基乙醇、青链霉素混合液购于美国Sigma公司；E.Z.N.A.总RNA分离试剂盒购于美国OMEGA公司；逆转录试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；定量PCR试剂盒（FAST SYBR Mixture）购自生工生物工程（上海）有限公司。引物由上海英潍捷基（Invitrogen）公司合成，序列见表1。

Tab.1 Sequences of primers for qPCR表1 定量PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 INS-1细胞的培养 RPMI-1640含10%胎牛血清，β巯基乙醇（50µmol/L），青霉素100 U/L，链霉素100 mg/L，置于37℃、95%O2、5%CO2的细胞培养箱中。将细胞接种于6孔板，培养约24 h后，将Ad-abcb1b腺病毒和阴性对照病毒以浓度50×106/L感染INS-1细胞，4 h后换成正常培养基继续孵育44 h，预冷PBS洗2遍后收集细胞于1.5 mL EP管中，备用。

1.2.2 大鼠胰岛的摘取 取野生型和转基因SD大鼠各5只，腹腔注射10%水合氯醛1.5～2 mL麻醉大鼠后，取仰卧位将其四肢固定于手术台上。75%乙醇消毒皮肤后，取正中切口，暴露腹腔脏器。找到胆总管，分别在十二指肠乳头端及近肝门处予1号丝线结扎。股动脉放血处死大鼠，于胆总管近肝门处0.45 mm头皮针穿刺，向胰腺内灌注浓度为1 g/L胶原酶Ⅴ约10 mL，至胰腺完全膨胀，迅速分离胰腺，置于50 mL离心管中，37℃水浴20～25 min后，预冷Hank's液约35～40 mL终止消化，用力摇晃离心管，使胰腺组织成泥沙状，静置5 min（冰浴），待其分层后弃上层液体，加入35～40 mL预冷Hank's液，洗涤2次。混匀后取3～5 mL消化物于平皿中，体式镜下手工挑拣胰岛，置于装有Hank's液的1.5 mL EP管中，备用。

1.2.3 细胞、胰岛RNA萃取及基因水平测定 将收集的细胞和胰岛按E.Z.N.A.总RNA分离试剂盒说明书萃取总RNA，逆转录试剂盒逆转录成cDNA。逆转录条件：25℃5 min，42℃1 h，72℃5 min。定量PCR试剂盒扩增，扩增条件：95℃预变性3 min；95 ℃扩增30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40个循环。熔解曲线分析：95℃ 5 s，65℃ 60 s，95℃1 s。根据qPCR得出的荧光曲线的Ct值，以 β-actin为内参，用2-ΔΔCt计结果，ΔCt=目的基因Ct值-β-actin Ct值，ΔΔCt=P-gp过表达组ΔCt值-对照组ΔCt值。实验结果以对照组的倍数表示。

1.3 统计学方法 统计分析采用GraphPad Prism 5进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组之间均数比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P-gp过表达对INS-1细胞分化的影响 腺病毒感染48 h后，qPCR结果显示，与阴性对照组相比，P-gp过表达组Ngn3、Mafb表达量增加，而Mafa表达量明显减低，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。

Fig.1 Effects of overexpression of P-gp on the differentiation of INS-1 cells图1 P-gp过表达对INS-1细胞分化的影响

2.2 P-gp过表达对胰岛β细胞分化的影响 qPCR结果显示，与野生型大鼠相比，P-gp过表达后，转基因大鼠胰岛组织中与胰岛β细胞分化相关的转录因子的mRNA表达量均无明显变化（P＞0.05），见图2。

Fig.2 Effects of overexpression of P-gp on the differentiation of rat pancreatic β cells图2 P-gp过表达对胰岛β细胞分化的影响

3 讨论

3.1 P-gp过表达可能导致INS-1细胞去分化 胰腺的发生发展受多种因子的共同调控，Ngn3主要是在发育中的胰腺内表达，在其下游因子Pax-4、Mafa等的作用下，表达Ngn3的阳性细胞分化为成熟β细胞。Mafa和Mafb是分别特异存在于β细胞和α细胞的转录因子，有研究发现，Mafa基因敲除的小鼠表现为β细胞与α细胞的比率降低，谱系追踪发现一部分α细胞是由β细胞转化而来，并且发现基因敲除鼠胰岛内的Mafb、Ngn3的表达增多［6］。这一研究说明Mafa、Mafb、Ngn3对维持成熟β细胞的功能有重要作用。本研究结果显示，P-gp过表达后，INS-1细胞的Ngn3、Mafb表达增加，而Mafa表达减少，说明P-gp过表达可能导致INS-1细胞去分化；这与之前Samant等［7］的结果相似，他们认为抑制MDR1的表达可以促进前列腺上皮细胞的分化，即P-gp有抑制分化的作用。

3.2 体内P-gp过表达对大鼠胰岛β细胞的分化无影响 本研究表明，P-gp过表达后，大鼠胰岛组织内各基因表达水平无明显差异，推测是由于大鼠体内胰高血糖素肽-1（GLP-1）、胃泌素以及胰岛内α细胞等的作用，阻止了胰岛β细胞去分化，从而维持β细胞的正常表型和功能。有人将基因改造后能分泌GLP-1的人共生菌喂养糖尿病大鼠，发现GLP-1组糖尿病大鼠的血糖明显改善，小肠上皮细胞中出现分泌胰岛素的细胞，并且Mafa、Pdx1的表达增加［8］。说明GLP-1能促进肠上皮细胞转化为胰岛素样细胞。另一研究发现，糖尿病小鼠给予GLP-1干预后，与胰岛β细胞分化的有关基因，如Pdx1、Neurod等的表达升高［9］。这些结果均表明GLP-1能促进β细胞的分化。近年研究表明，GLP-1与胃泌素协同作用，共同促进、维持β细胞的功能和增殖。Suarez-Pinzon等［10］对糖尿病小鼠分别给予GLP-1、胃泌素、GLP-1+胃泌素后发现，与另外两组相比，GLP-1+胃泌素组能显著降低小鼠血糖，且β细胞质量增加，同时检测到胰腺导管来源的胰岛素阳性细胞，这一结果也被日本科学家证实［11］。有学者认为β细胞是由α前体细胞分化而来［12］。当β细胞受到损伤时，体内反馈系统激活，α细胞可以转分化成为β细胞，导致β细胞再生增加。有研究显示，在β细胞几乎被破坏5个月后，实验小鼠可以不再依赖胰岛素而存活，并且一部分小鼠血糖得到明显改善，同时β细胞质量较破坏初期增加数十倍，进一步溯源发现这些再生的细胞并不是仅存的β细胞的复制，而是由之前存在的α细胞转分化形成［13］。最近有一项研究证明分泌生长抑素的胰岛δ细胞与β细胞之间的旁分泌作用对维持血糖的稳定有重要作用，消除了δ细胞的新生小鼠发生了严重的低血糖并很快死亡［14］。

综上，笔者认为INS-1细胞内P-gp过表达可能使其去分化，而大鼠胰岛β细胞中P-gp过表达对其分化无明显影响。转基因大鼠胰岛内Mafa、Mafb、Ngn3等因子表达水平与对照组相比无明显差异，笔者认为可能是由于体内各种激素、体液因子、旁分泌以及细胞之间复杂的关系所导致的，其具体的机制有待进一步研究。