艾灸对缺氧缺血性脑病新生小鼠脑组织炎症细胞浸润和CD11b表达的影响

肖爱娇，肖移生，欧阳昕，贺琳，陈明人△

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是新生儿时期较为常见的疾病之一，是指各种围生期窒息引起的部分或完全缺氧，脑血流减少或暂停而导致胎儿或新生儿脑损伤［1］。该病具有较高的致死率和致残率［2-3］。研究表明，炎症反应可能在新生儿HIE的发病过程中起重要作用［4-5］。Smith等［6］研究发现，脑缺氧缺血时，脑组织出现大量炎症细胞浸润，且浸润的炎症细胞主要是CD11b阳性细胞（小胶质细胞的重要标志物）。本课题组前期研究显示，脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中CD11b表达增加［7］。

艾灸作为一种传统的中医疗法，临床上广泛应用于卒中等疾病的治疗，并取得了较好的效果。动物实验研究显示，艾灸具有减轻脑缺血再灌注损伤、减少CD11b阳性细胞的作用［7］，提示小胶质细胞可能参与了缺血性脑损伤的病理过程；艾灸可能通过减少小胶质细胞浸润来减轻脑缺血再灌注损伤。有关艾灸能否通过减少炎症细胞（如小胶质细胞）浸润，缓解炎症反应，从而减轻新生小鼠缺氧缺血性脑损伤尚未明确。为此，本文在前期研究的基础上，观察艾灸对模型小鼠脑组织炎症细胞浸润及脑组织CD11b阳性细胞的影响，探讨艾灸减轻新生小鼠缺氧缺血性脑损伤的可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 清洁级ICR小鼠64只，出生7 d，雌雄不拘，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司［SCXK（湘）2013-0004］。一抗：ab75476兔抗小鼠CD11b购自艾博抗（上海）贸易有限公司；二抗：A11011山羊抗兔、P36931荧光封片剂［含DAPI（4′-6′diamino-2-phenylindole，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）购自美国Invitrogen公司。DL-SSJ头戴式手术显微镜购自中国DL公司，Leica 2000荧光显微镜及图像分析软件购自德国Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 新生小鼠随机分为3组。HI模型组24只：闭合左侧颈总动脉，并给予缺氧处理。艾灸组20只：同模型组，并于缺氧处理后进行艾灸治疗，35 min/次，1次/d。假手术组20只：只做颈部手术，不闭合颈总动脉，不缺氧。

1.2.2 HIE模型制备 参照Rice等［8-9］方法制备HIE新生小鼠模型：（1）动物在异氟烷吸入麻醉状态下行颈部正中切口，分离、闭合左侧颈总动脉，缝合切口。（2）动物在室温中苏醒和母乳喂养2 h后，进行缺氧处理，即将动物置于37℃的密闭舱内，通入氮气（N2），调节氧气（O2）浓度为8%，100 min后取出。

1.2.3 艾灸取穴 参考文献［10］中针灸腧穴定位方法取“大椎”穴作为治疗穴位。大椎穴位于督脉上，第7颈椎与第1胸椎棘突间，背部正中。艾灸方法：在脑缺血缺氧后次日，艾灸“大椎”穴进行治疗，每日1次，35 min/次。

1.2.4 脑组织梗死检查 于造模后3 d，假手术组、模型组及艾灸组分别取6、10及6只鼠进行脑组织TTC染色。给予小鼠异氟醚吸入麻醉后迅速取脑，以1.5 mm左右间隔自额向枕切成4个冠状切片，加入1%TTC染液，置于37℃温箱中染色20 min，用扫描仪进行扫描，Image J软件（National institute of Health，USA）测量每张脑片的梗死面积，并计算梗死面积百分比。梗死面积计算参见文献［11-13］：梗死面积（%）=［健侧半球面积-（患侧半球面积-梗死面积）］/健侧半球面积×100%。

1.2.5 脑组织形态学观察 于造模后3 d，各组分别取7只鼠进行脑大体形态学观察。给予动物异氟醚吸入麻醉后迅速取脑，数码相机拍照。然后切片，厚5µm，HE染色后封片，显微镜（×200）观察。

1.2.6 脑组织CD11b阳性细胞数检测 于造模后3 d，各组分别另取7只鼠进行荧光免疫组织化学法检测，参见文献［7］进行操作。脑组织CD11b阳性的部位呈红色，细胞核呈蓝色，用Image J软件进行图像分析，计数每个视野下（×200）的CD11b阳性细胞数。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 5进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，不符合者进行lg对数转换后进行计算，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重性比较采用Tukey法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑组织梗死观察 假手术组脑组织经TTC染色后全部染成红色，未见梗死灶；模型组右侧半球呈红色，左侧半球出现白色梗死灶，梗死比例为（36.46±19.72）%；艾灸组右侧半球呈红色；左侧半球出现小面积白色梗死灶，梗死比例为（19.92±10.10）%，较模型组减少（F=11.900，P＜0.05），见图1。

Fig.1 TTC staining of brain coronal section of mice图1 脑组织TTC染色结果

2.2 脑组织形态学观察 （1）大体观察。假手术组脑组织红润，脑沟及脑回清晰，左右半球基本对称；模型组左侧脑组织萎缩、塌陷；艾灸组左侧脑可见小面积白色梗死灶，脑沟变浅，见图2。（2）镜下观察。假手术组脑组织细胞排列整齐、致密；模型组患侧脑组织细胞排列疏松，可见大量细胞脱落，以及大量炎症细胞浸润；艾灸组患侧脑组织排列较整齐、致密，有少量炎症细胞浸润，见图3。

Fig.2 Pictures showing gross morphology of mouse brain图2 小鼠脑大体形态学观察

2.3 各组脑组织CD11b阳性细胞数比较 假手术组、模型组及艾灸组的患侧脑组织CD11b阳性细胞数分别为7.74±4.11、42.00±13.01及14.57±3.05（单位：个；F=35.350，P＜0.05），其中模型组多于假手术组，而艾灸组少于模型组（P＜0.05）；假手术组与艾灸组差异无统计学意义，见图4。

Fig.3 HE staining of brain section of mice(×200)图3 小鼠脑组织HE染色情况（×200）

Fig.4 The expression of CD11b in mouse brain detected by immunofluorescence staining（×200）图4 组织免疫荧光染色检测小鼠脑组织CD11b表达结果（×200）

3 讨论

艾灸作为针灸疗法的重要组成部分，是借助艾草燃烧时发出的药力和红外线温热刺激，来熏灼特定的穴位，刺激组织以调和气血、疏通经络，从整体上调节脏腑功能，以达到治病防病、养生保健的目的。该疗法操作简便，疗效显著，无任何不良反应，日益受到患者的青睐。然而，有关艾灸治疗急性新生儿缺氧缺血性脑病的报道很少，其治疗急性新生儿缺氧缺血性脑病的作用机制研究也并不多见。为此，本实验首先制备缺氧缺血性脑损伤新生小鼠模型，观察艾灸治疗新生小鼠缺氧缺血性脑损伤的疗效。经TTC染色后观察发现，假手术组小鼠脑组织被染成红色，未见梗死灶；模型组和艾灸组小鼠左侧半球都可见白色梗死灶，经计算分析，模型组小鼠脑梗死面积较大，而艾灸组小鼠脑组织梗死面积明显缩小，差异有统计学意义。此外，从脑的大体观察来看，假手术组小鼠的脑组织红润，脑沟及脑回清晰，左右两半球基本对称；模型组小鼠左侧脑半球明显萎缩、塌陷，脑沟和脑回消失；而艾灸组小鼠左侧脑梗死灶明显缩小。由此可见，艾灸“大椎”穴可有效地减轻新生小鼠缺氧缺血性脑损伤。

多项研究显示，在新生儿缺氧缺血性脑损伤的发病机制中，有许多相互关联的机制在起作用，涉及的主要病理生理过程有兴奋性毒性、细胞凋亡和炎症等。其中，炎症反应可能在新生儿HIE的病理过程中起重要作用［4-5］。炎症细胞浸润是炎症反应的重要病理特征，这些炎症细胞在发挥吞噬作用、免疫调节作用的同时，也可向细胞外释放大量活性氧自由基、炎症细胞因子、基质金属蛋白酶（MMPs）、白细胞介素等炎症介质［14］，进一步介导内皮细胞和组织损伤，加重原始炎症级联反应，导致脑损伤加剧。本研究HE染色结果显示，模型组患侧脑组织大量细胞脱落，细胞排列疏松，且大量炎症细胞浸润；而艾灸组患侧脑组织排列较整齐、致密，仅有少量炎症细胞浸润，表明新生小鼠缺氧缺血后确实发生了炎症反应，而艾灸具有减少炎症细胞浸润、减轻炎症反应的作用。

小胶质细胞是中枢神经系统的重要免疫细胞，属于巨噬细胞的一种。活化的巨噬细胞在病原体等刺激下，一方面可发挥抗感染和免疫调节作用，另一方面也可产生大量促炎症细胞因子和其他炎症介质，介导炎症反应。研究显示，缺氧缺血性脑病早期可见小胶质细胞激活［15-17］。CD11b是小胶质细胞的重要标志物，Smith等［6］研究也显示脑缺氧缺血时主要为CD11b阳性细胞浸润。本研究显示新生小鼠脑缺氧缺血后3 d，模型组患侧脑组织CD11b表达明显增加，与上述研究结果［6-7］基本一致，而经艾灸治疗后，艾灸组患侧脑组织CD11b表达减少，提示小胶质细胞参与了急性新生小鼠缺氧缺血性脑损伤的病理过程，而艾灸可能通过减少小胶质细胞浸润，减轻炎症反应。

综上所述，艾灸“大椎”穴可能通过激发和调动机体自身的抗病能力，减少小胶质细胞浸润，减轻炎症反应，从而达到减轻新生小鼠缺氧缺血性脑损伤。这也为临床上运用艾灸治疗急性新生儿缺氧缺血性脑病提供了一条新途径。