基于生物信息学方法探讨Her-2基因表达对胃癌免疫细胞浸润的影响

张静 游路宽 胡毅

胃癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤，超过2/3的患者确诊时已属晚期，预后不佳［1］。据报道，8%～53%的胃癌与人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）蛋白过表达有关［2］。Her-2是由ERBB2基因编码的ERBB家族受体重要成员之一，可与其他家族成员结合形成异源二聚体，通过激活下游RAS-RAF-MEK-ERK通路或PI3KAKT-mTOR通路向细胞传递增殖和存活信号。当细胞Her-2过表达或功能增加时，可向下游传递过多细胞增殖信号，从而导致肿瘤形成［3］。此外，Her-2还可激活血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体VEGFR的启动子，增加 VEGF和VEGFR蛋白表达与释放，促进肿瘤细胞浸润和转移［4-5］。此外，以往有研究发现Her-2抑制剂可诱导强烈的肿瘤淋巴细胞浸润，同时依赖免疫调节作用而发挥抗癌作用［6］。近期国内学者发现Her-2或通过抑制cGAS-STING通路抑制肿瘤免疫微环境中的免疫细胞，从而发挥抗肿瘤作用［7］。本研究通过生物信息学方法分析人类癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库的胃癌相关数据，在基因水平探讨Her-2对胃癌免疫微环境免疫细胞浸润的潜在影响，为后续研究Her-2与胃癌关系奠定基础。

1 资料与方法

1.1 数据来源

胃癌数据来源于TCGA。以“Stomach adenocarcinoma”为关键词，从癌症数据共享（GDC）网站（https：//portal.gdc.cancer.gov/repository）下载407例胃癌患者的RNA-Seq数据，以及临床信息、预后等资料，其中癌组织样本375例，癌旁组织样本32例。排除缺少癌旁组织样本及临床资料不全者，最终共纳入354例胃癌患者的RNA-Seq数据。同时从GEO数据库下载30例胃癌样本转录组数据的GSE36968作为验证数据集。

1.2 肿瘤浸润免疫细胞评估

CIBERSORT是一种基于转录组数据评估肿瘤组织中22种免疫细胞占比的计算方法，通过574个标记基因表达值进行反卷积，从而估算肿瘤组织中不同免疫细胞的比例［8］。本研究采用该算法计算胃癌组织中22种免疫细胞的浸润占比，并采用R软件（版本号3.6.0）对354例胃癌样本进行CIBERSORT分析，每个样本获得一个P值，P值＜0.05的样本纳入后续分析。以Her-2 mRNA表达水平的中位数（4.52）为界，将354例样本分为高表达组和低表达组。

1.3 基于特定基因标识的功能变化分析

基因集变异分析（gene set variation analysis，GSVA）是评估转录组基因集富集情况的一种非参数无监督分析方法［9］。GSVA通过对感兴趣的基因集合进行综合打分，将基因水平变化转变为通路水平变化，进而判断样本的生物学功能。本研究从Molecular Signatures Database数据库（v7.0版）（http：//software.broad-institute.org/gsea/msigdb）下载基因集合，采用GSVA算法对每个基因集合进行综合打分，评估不同样本潜在的生物学功能变化。

1.4 统计学方法

采用R 3.6.0软件进行数据分析。采用秩和检验分析Her-2高表达组和Her-2低表达组样本浸润免疫细胞占比的差异；Pearson相关分析各种免疫细胞浸润程度的相关性。基于GSVA方法，采用Pearson相关系数衡量179例胃癌样本相关基因信号通路表达与Her-2表达的关系。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIBERSORT分析结果

CIBERSORT分析结果显示，179例胃癌样本中静息状态记忆性CD4+T细胞占比最高（16.5%），随后占比自高到低依次为CD8+T细胞（11.1%）、幼稚B细胞（10%）、M2型巨噬细胞（8.8%）、M0型巨噬细胞（7.5%）等。见图1A。

CIBERSORT方法评估两组免疫细胞浸润的情况，结果显示179例（Her-2低表达组104例，高表达组75例）样本的免疫细胞浸润程度差异有统计学意义（P<0.05）。104例Her-2低表达组和75例高表达组样本的CD8+T细胞、静息状态记忆性CD4+T细胞、M0型巨噬细胞及肥大细胞浸润程度差异亦有统计学意义（P=0.029，0.049，0.027，0.008），其中 CD8+T 细胞及肥大细胞在Her-2低表达组中的浸润程度较高表达组高，而静息状态记忆性CD4+T细胞和M0型巨噬细胞在Her-2低表达组中的浸润程度低于高表达组。见图1B。

2.2 179例胃癌样本中免疫细胞浸润程度的相关性

Pearson相关分析179例胃癌样本中22种免疫细胞浸润程度的相关性，结果显示，CD8+T细胞、静息状态记忆性CD4+T细胞、M0型巨噬细胞及肥大细胞等4种存在浸润差异的免疫细胞浸润程度具有相关性，其中CD8+T细胞与静息状态记忆性CD4+T细胞、M0型巨噬细胞及肥大细胞浸润程度均呈负相关（r=-0.36，-0.46，-0.33），静息状态记忆性 CD4+T 细胞与M0型巨噬细胞及肥大细胞浸润程度亦均呈负相关（r=-0.05，-0.19），M0型巨噬细胞与肥大细胞浸润程度呈正相关（r=0.36）。见图1C。

2.3 GSVA分析结果

通过GSVA方法对179例胃癌样本进行GO分析（采用GO gene sets基因集对样本进行打分），结果显示Her-2基因表达与CD8+T细胞、静息状态记忆性CD4+T细胞、M0型巨噬细胞及肥大细胞的发育、诱导分化、迁移调控相关，且影响这4种免疫细胞的浸润能力和程度，见表1。KEGG分析（采用curated gene sets基因集对样本进行打分）Her-2基因表达可能影响179例胃癌样本的潜在代谢通路，发现Her-2基因表达升高与相关肿瘤形成信号有关，见表2。

2.4 GEO数据验证分析结果

采用CIBERSORT算法分析GEO数据GSE36968中30例胃癌样本的转录组数据，发现Her-2基因表达对肿瘤免疫细胞浸润的影响与TCGA数据库分析结果基本一致。见图2。

表1 采用GSVA进行GO分析的结果Tab.1 Results of GO analysis using GSVA

图1 TCGA数据的CIBERSORT分析结果Fig.1 Results of CIBERSORT analysis of TCGA data

图2 GEO数据的CIBERSORT分析结果Fig.2 Results of CIBERSORT analysis of GEO data

表2 采用GSVA进行KEGG分析的结果Tab.2 Results of KEGG analysis using GSVA

3 讨论

机体对肿瘤产生的免疫应答是主要以CD8+T细胞为主的免疫细胞浸润至肿瘤组织并参与肿瘤免疫循环的过程［10-11］。机体早期通过免疫监视功能可对肿瘤进行免疫清除，同样肿瘤细胞也可通过免疫编辑作用抑制免疫系统甚至可以通过多种机制逃避免疫系统的攻击［12-13］。随着全球范围内有关胃癌Her-2研究数据及抗Her-2靶向治疗经验的积累，人们对Her-2在胃癌诊疗中的意义也有了更深刻的认识。但既往研究大多集中于报道Her-2与肿瘤细胞生长及细胞凋亡的关系，Her-2与肿瘤免疫循环的研究相对较少。近期，有研究发现Her-2可与STING羧基端尾部结合，同时可利用AKT1特定位置磷酸化抑制TBK1活性，阻止STING与TBK1结合而抑制抗肿瘤免疫活性，肿瘤细胞内的Her-2水平及活性也可能是控制免疫感知能力和相关免疫反应表型的决定性因素［7，14-16］。

本研究通过CIBERSORT方法分析Her-2基因低表达及高表达胃癌样本中免疫细胞的浸润情况，发现Her-2基因高表达组静息状态记忆性CD4+T细胞及M0型巨噬细胞占比相对Her-2基因低表达组高，而CD8+T细胞及肥大细胞占比较Her-2基因低表达组低。机体免疫应答包含天然免疫应答和适应性免疫应答，需各种细胞及因子参与。与初始T细胞相比，记忆T细胞因其表面分子已发生改变且信号传递在细胞内存在差异，再次免疫应答时记忆T细胞可更快、更易激活，从而快速高效介导免疫应答［17］。在本研究中，相对于Her-2基因低表达组，Her-2基因高表达组胃癌组织中静息状态记忆性CD4+T细胞较多，而CD8+T细胞在两组中的占比则相反。该结果表明Her-2高表达的肿瘤组织，其微环境中的记忆性CD4+T细胞未被活化，且CD8+T细胞浸润程度也明显低于Her-2低表达的肿瘤组织。进一步通过GSVA分析，发现Her-2表达程度与CD4+T细胞受体结合呈负性相关，这意味着Her-2高表达的肿瘤组织，其微环境内的CD4+T细胞与肿瘤抗原的结合反而降低，从而导致静息状态记忆性CD4+T细胞无法活化为效应性T细胞，减少了细胞因子（如IFN-γ及IL-4等）分泌，降低对CD8+T细胞的趋化作用，进而导致CD8+T细胞浸润程度降低［18］。免疫细胞的浸润程度相关性分析中，CD8+T细胞与静息状态CD4+记忆性T细胞浸润程度呈负相关亦证实这一结果。

作为有高度可塑性的M0型巨噬细胞，在IFN-γ或细菌脂多糖的诱导下能活化形成M1型巨噬细胞，并释放多种抗肿瘤细胞活化因子，同时可激活机体特异性免疫应答。M0型巨噬细胞亦可在Th2细胞释放的IL-4和IL-13等诱导活化形成M2型巨噬细胞，并释放多种炎症或免疫抑制分子，从而抑制炎症反应和促进肿瘤生长和转移［19］。如前所述，在Her-2基因高表达组中，因为静息状态的记忆性CD4+T细胞未能被肿瘤组织抗原“活化”，导致IFN-γ、IL-4及IL-13等细胞因子生成减少，从而抑制M0型巨噬细胞向其他类型巨噬细胞转化，致使肿瘤微环境中M0型巨噬细胞增高，而减少的细胞因子则降低对CD8+T细胞浸润的趋化，这一结果在M0型巨噬细胞与CD8+T细胞浸润程度相关性分析中亦得以印证。结合GSVA的GO分析结果还发现Her-2基因高表达与巨噬细胞集落刺激因子的形成及应答、巨噬细胞因子产生的负性调控以及巨噬细胞迁移的负性调控等生物学途径均呈不同程度负相关，因此推测Her-2基因高表达可能限制了M0巨噬细胞进一步发育分化。

肥大细胞能分泌多种细胞因子和介质，影响淋巴细胞的特异性反应，参与免疫调节，还参与抗原呈递［20］。本研究中Her-2基因高表达组的肥大细胞占比较Her-2基因低表达组少，结合GSVA中GO分析结果发现Her-2基因高表达与肥大细胞分化、化学趋化因子及肥大细胞迁移呈负相关。推测可能是Her-2基因高表达导致肿瘤组织释放的肥大细胞趋化因子减少，从而使Her-2基因高表达的肿瘤组织中肥大细胞浸润较少。为了验证TCGA数据库分析结果，本研究采用GEO收录的胃癌转录组数据进一步验证Her-2基因表达与胃癌免疫细胞浸润程度的关系，结果与TCGA数据库分析结果基本一致。说明Her-2基因高表达一定程度上可抑制胃癌组织中以上抗肿瘤免疫应答的“正面因素”。

本研究通过生物信息学方法分析发现胃癌中Her-2基因高表达可能对免疫系统产生一定抑制作用，进而影响免疫系统发挥抗肿瘤作用，但本研究仅基于生物信息学分析，有关结论仍需通过大样本临床研究加以验证。