贝伐珠单抗对复发性卵巢癌Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达情况及临床治疗效果的影响

孙丽敏 ，蔡芳 ，牛东升 ，孙晓 ，曹艳阳

(1.南阳市第二人民医院妇产科，河南 南阳473000；2.南阳市肿瘤医院肿瘤科，河南 南阳 473000)

卵巢癌作为女性生殖系统较为常见的恶性肿瘤，发病率位居妇科生殖道肿瘤第三位。研究表明卵巢癌解剖位置过深、起病隐匿、早期症状不典型且对该病缺乏应有的流行病调查和早期诊断措施，造成卵巢癌早期诊断率低下、误诊率较高。一旦确诊，70%患者即处于晚期，其预后不良[1，2]。目前关于该病治疗以肿瘤细胞减灭术为主、辅以铂类药物和紫杉醇进行全身化疗，其中75%患者可以完全缓解，但最终会出现60%～70%的近期或远期复发率，即复发性卵巢癌[3，4]。研究表明关于复发性卵巢癌的初次治疗会对多数药物产生耐药，特别是铂类药物，二次手术或化疗等方法均难以达到临床治愈的目的，所以探寻一种新的治疗方法具有重要临床价值[5]。但目前有关复发性卵巢癌治疗尚无统一标准，各个地区则是按照自己的治疗原则和用药经验选取相应的治疗方法，但再次治疗并不能达到真正的治愈目的，而是尽可能的延长患者无进展生存期、总体生存期及改善患者生存质量等[6，7]。近年来随着医学发展，出现了生物靶向治疗，该方法以恶性肿瘤病理异常分子为靶点，通过与靶分子特异结合的抗体配体，利于阻断或封闭肿瘤发生、进展中具有决定性作用的生长因子或激酶产生，有助于对肿瘤新生血管产生破坏作用，起到导向治疗的效果，为复发性卵巢癌的治疗提供了新思路与新方法[8]。但关于该方面的研究鲜有报道[9]，不利于复发性卵巢癌治疗。本研究选取贝伐珠单抗治疗复发性卵巢癌且试图探明与B淋巴细胞瘤-2蛋白 （Bcl-2）、Bcl-2相关 X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表达的相关性，旨在提高复发性卵巢癌治疗效果、明确贝伐珠单抗作用机理，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年2月至2017年10月南阳市第二人民医院复发性卵巢癌患者148例，入选标准：⑴符合复发性卵巢癌诊断标准且经组织病理学证实或影像学证据确诊。⑵距离上次化疗停止时间6～12个月。⑶病理分期Ⅱ～Ⅳ期且预期生存期3个月以上。⑷美国东部肿瘤协助组评定的活动状态评分0～2分。⑸肿瘤无出血病史。⑹签署知情同意书，自愿参加。排除标准：⑴精神疾病、沟通障碍。⑵心肺肝肾功能严重异常。⑶卵巢癌合并其他恶性肿瘤及传染性疾病。⑷妊娠及哺乳期女性。⑸既往接受过分子靶向干预。⑹急慢性感染。⑺未遵循本研究规定及因不良反应退出的病例。年龄34～68岁，病理类型：浆液性癌129例、子宫内膜样癌11例、混合性癌8例，分期：Ⅱ期26例、Ⅲ期113例、Ⅳ期9例，复发灶直径：≤5cm95例、＞5cm53例，复发灶数量：单发 57例、多发91例。按照奇偶法，将纳入患者分为观察组和对照组（每组74例），比较两组患者年龄、病理类型、分期、复发灶情况等一般资料，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。本研究符合医学伦理要求，经过医院伦理委员会批准。

1.2 方法 对照组采用常规化疗方法，即多西他赛+奈达铂，其中多西他赛注射液（生产厂家：深圳万乐药业有限公司，国药准字H2052067，规格0.5mL：20mg/瓶）75mg/m2，第一天使用；注射用奈达铂（生产厂家：南京先声东元制药有限公司，国药准字 H20030884，规格 10mg/支）80mg/m2，化疗第二天使用，每三周为一次化疗周期，化疗前常规采用地塞米松（生产厂家：郑州卓峰制药有限公司，国药准字 H41020056，规格 1ml：2mg/瓶支）和盐酸格拉司琼分散片（生产厂家：广西浦北制药厂，国药准字H20020303，规格1mg/片）；根据患者体表面积计算多西他赛和奈达铂使用剂量，常规予以两个化疗周期。

观察组采用贝伐珠单抗联合常规化疗方法，贝伐珠单抗注射液（生产厂家：上海罗氏制药有限公司，批准文号HK-59450，规格4ml：100mg/瓶）7.5mg/kg+0.9%氯化钠注射液（生产厂家：四川科伦药业股份有限公司，国药准字H20056626，规格250ml/瓶）250ml于化疗前60min内输注完毕；化疗方法同对照组，常规予以两个周期。两组患者治疗期间加强血尿粪常规、心肺肝肾功能、凝血功能和肿瘤标志物监测，确保治疗顺利进行。

1.3 观察指标 观察和记录两组患者治疗前后实体瘤大小、血清糖类癌胚抗原 125（CA125）、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达和不良事件及分级。

其中实体肿瘤大小：采用德国西门子Biograph TruePoint 64PET/CT检查，利用TrueX法重建图像、层厚3mm获得横轴面、矢状面、冠状面PET图像、CT图像和PET/CT融合图像；选取病灶放射性浓度最高层面勾画感兴趣区，系统自动测量病灶最大标准摄取值，予以定量分析。CA125测定：于清晨抽取患者肘部静脉血5ml，以3000r/min离心10min，分离血清，采用全自动化学发光免疫分析仪（美国雅培公司生产，型号Architect i2000），利用双抗体夹心ELISA法检测 （试剂盒由武汉优尔生科技股份有限公司提供）。Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白测定：于清晨空腹抽取肘部静脉血5mL，置入真空静脉采血管（生产厂家：美国BD公司提供），3.8%乙二胺四乙酸二钾抗凝。混匀后常温下，采用Ficoll-hypzue淋巴细胞分离液（美国Proteintech公司提供）分离出外周血单个核细胞（PBMCs），利用0.01mol/L磷酸缓冲液（PBS，武汉博士得生物技术有限公司提供）洗涤细胞，用Trizol（美国GIBCO公司提供）提取细胞总蛋白，通过Infinite F50酶标仪（瑞士Tecan公司提供）、采用BCA法测定蛋白浓度 （上海碧云天生物技术公司提供BCA蛋白浓度测定试剂盒）；制备10%分离胶和5%浓缩胶，各孔加30ug总蛋白予以聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDSPAGE）垂直凝胶电泳分离不同相对分子质量蛋白质后，转移蛋白到PVDF膜（德国Millipore公司提供），于TBST配置的10%脱脂奶粉室温封闭20min，分别加入 Bcl-2、Bax、Caspase-3 一抗（美国Proteintech公司提供）孵育、于4°C冰箱中过夜；漂洗3次后，加入FITC标记羊抗鼠IgG二抗（由美国Proteintech公司提供）、室温孵育120min。采用ECL化学发光 （超敏ECL化学发光试剂盒由美国Proteintech公司提供），予以显色、成像。通过Quantity One软件（美国UVP公司提供）定量分析条带，将GAPDH作为参考，利用目的蛋白光密度值和GAPDH光密度值的比值表示目的蛋白的相对表达浓度。

表1 两组患者一般资料分布

1.4 评价标准[10]临床疗效评价标准：⑴按照实体肿瘤评价：①完全缓解：肿瘤完全消失且持续四周以上；②部分缓解：肿瘤长径总和下降≥50%且无进展表现，持续四周以上；③稳定：肿瘤长径总和下降25%～49%且持续四周以上；④进展：肿瘤长径总和增加＞50%，或出现新转移灶。总有效=完全缓解+部分缓解+稳定。⑵按照CA125水平评价：①完全缓解：CA125水平不足35U/ml且持续四周以上；②部分缓解：CA125水平下降50%且持续四周以上；③稳定：CA125水平下降或升高＜25%且持续四周以上；④进展：CA125水平相对之前升高≥25%且持续四周以上。总有效=完全缓解+部分缓解+稳定。

不良反应评价标准[11]：参考世界卫生组织关于“抗癌药物常见不良反应分级标准”共计四级，0级：无不良反应，1级：轻度不良反应，2级：中度不良反应，3级：重度不良反应，4级：危及生命评价。

1.5 统计学分析 数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，正态计量数据用（）表示，计数资料采用例数或百分比表示，两组独立、正态、方差齐性资料组间比较采用t检验，等级资料组间比较采用秩和检验，样本率比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者治疗效果构成比 按照实体瘤标准，观察组治疗完全缓解率、总有效率均高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。按照CA125标准，观察组治疗完全缓解率、总有效率均高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.2 两组患者治疗前后Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达比较 治疗后，观察组Bcl-2表达低于对照组，Bax、Caspase-3蛋白表达高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 见表 3。

2.3 两组患者不良反应构成比 观察组不良反应构成比与对照组比较，差异无统计学意义 （P＞0.05）。 见表 4。

3 讨论

研究表明复发性卵巢癌治疗尚无统一方法和统一标准，但多数专家认为该病的治疗既需考虑以往治疗状况，又要根据患者意愿、完全缓解期和生存质量等方面制定个体化的治疗方法。如手术中的二次肿瘤细胞减灭术能有效根除复发肿瘤、减轻肿瘤负荷，为深入治疗创造条件，但手术风险大，患者基础条件要求高，对部分患者而言应慎重选取[12，13]。放化疗被临床视为重要的治疗方法，能有效阻断肿瘤进展、延长缓解期和患者生存期，但放化疗副作用大，患者依从性不佳、生存质量低下。近年来随着医疗技术不断进展，分子靶向治疗成为目前关注热点，该方法通过正常细胞和肿瘤细胞分子生物学上部分酶表达和信号传导通路不同，选择性的将药物作用于靶细胞、组织或器官内，从而具备杀伤肿瘤细胞的作用。其中单克隆抗体治疗含有抗血管内皮生长因子的单抗和抗表皮生长因子受体单抗[14，15]。研究表明血管内皮生长因子在新生血管生成中具有重要价值，能刺激血管生长且提升血管通透性，利于新生血管网络形成而能促进肿瘤生长与侵袭[16]，为复发性卵巢癌治疗提供了新思路与新方法。

表2 两组患者治疗效果构成比（%）

表3 两组患者治疗前后Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达比较

表4 两组患者不良反应构成比（%）

基于上述认知，本研究采用贝伐珠单抗治疗复发性肿瘤且观察Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达情况，结果表明贝伐珠单抗治疗复发性肿瘤效果显著，能明显缩小实体瘤大小、降低CA125水平，且优于单纯化疗结局。究其原因可能是由于贝伐珠单抗是一种重组人类单克隆IgG1抗体，以血管内皮生长因子为靶点，通过抑制内皮细胞增殖和新血管生成，阻断了恶性肿瘤生长与转移；且肿瘤血管发生退化，有助于阻断肿瘤细胞生长所需营养供应途径；另外，通过促进肿瘤血管正常化，利于降低肿瘤组织间渗透压，确保化疗药物向肿瘤组织内的传送，使化疗效果倍增。本研究结果还表明采用贝伐珠单抗后，复发性卵巢癌患者Bcl-2表达减弱，Bax、Caspase-3蛋白表达升高，说明贝伐珠单抗能有效抑制肿瘤发生与发展，进一步印证了贝伐珠单抗治疗复发性卵巢癌的有效性。因为文献资料显示Bcl-2是早期发现的凋亡抑制因子，通过参与细胞凋亡能有效抑制肿瘤细胞死亡而具有促进肿瘤细胞发生与发展的作用，且Bcl-2过度表达与肿瘤细胞的侵袭、转移和与多种化疗药物耐药性关系密切[17]；另外Bcl-2能阻断Bax蛋白对受损线粒体外膜发挥抗凋亡功效，且可以干扰Caspase-3蛋白活性而阻止细胞凋亡；Bax则可以促进细胞凋亡，若细胞过度受损，则表现为调控Bcl-2蛋白表达下降、Bax蛋白表达升高，Bcl-2/Bax比例降低；Caspase-3被认为是细胞凋亡中的关键蛋白酶，作为凋亡级联反应途径中的重要环节，一旦细胞受到凋亡刺激即会被激活，从而导致细胞凋亡[18，19]。因此 Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表达在肿瘤发生与发展中占据重要地位，其表达与肿瘤分期、分级密切相关。结合药物不良反应率，结果显示贝伐珠单抗相对安全，利于患者接受。

综上所述，贝伐珠单抗治疗复发性卵巢癌疗效显著、安全可靠，且能有效调节Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达抑制肿瘤发生与发展，丰富了复发性卵巢癌发生与发展机制学说，为临床治疗提供了一定参考依据。