2 种炮制方法对何首乌中6 种成分变化的影响

杨 磊， 刘梦娇， 陈文明， 戴 冰， 张志国， 张 琴∗

（1. 湖南中医药大学第一附属医院， 湖南 长沙410007； 2. 全国名老中医药专家张志国传承工作室， 湖南长沙410007； 3. 湖南中医药大学， 湖南 长沙410208）

何首乌为蓼科植物何首乌 Polygonum multiflorum Thunb. 的块根， 生品解毒消痈、 截疟、润肠通便， 炮制品补肝肾、 益精血、 乌须发［1］，临床多以制何首乌入药， 最早见于唐朝《何首乌传》， 历朝历代均有记载。 纵观古籍文献， 何首乌炮制方法大致分为净制、 切制、 不加辅料制、 加辅料制、 药汁制几大类， 约20 余种［2］， 经历了由简到繁的炮制过程， 其中“九蒸九晒” 法大致形成于宋朝， 并沿用到近代， 是其经典炮制方法， 由于古法炮制的繁琐、 耗时、 耗能， 不能满足中药现代化工业生产的要求， 故逐渐简化成《中国药典》记载的“炖至液汁吸尽” 或“蒸至内外均呈棕褐色” 时晒干切片［1］。 目前， 有大量学者对药典所载炮制方法的工艺、 化学成分、 药理药效等展开研究［3-7］， 但鲜有将“九蒸九晒” 法与药典方法进行对比研究。 本实验拟将2 种炮制方法对何首乌中6种成分含有量的变化进行研究， 为进一步阐明两者对该药材疗效和毒性的影响提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent Techologies 1260 InfinityⅡ型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）； JJW-3KVA 型精密净化交流稳定电源、 SK-5200H 型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）； XMTB-8000 型干燥箱（余姚市金宏仪器厂）； AR2140 型电子分析天平（上海海鸿精密仪器有限公司）。

1.2 试药 二苯乙烯苷对照品 （批号110844-201512）、 大黄素对照品（批号0756-200110）、 大黄素甲醚对照品（批号758-9301）、 大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品（批号Z25A7B13739）、 没食子酸对照品（批号0831-9501）、 5-羟甲基糠醛对照品（批号A22J7L16607） 均由中国食品药品检定研究院提供。 乙腈（色谱纯）、 甲醇（分析纯）、 磷酸（色谱纯） 购于天津市科密欧化学试剂有限公司； 水为超纯水。

何首乌购于湖南南国药都中药饮片有限公司，经湖南中医药大学中药炮制教研室张志国教授鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb. 的干燥块根； 黑豆为市售。

2 方法与结果

2.1 样品制备

2.1.1 “九蒸九晒” 炮制品 根据前期实验确定的条件， 取黑豆60 g， 加6 000 mL 水煮4 h， 熬汁900 mL， 豆 渣 再 加 水4 800 mL 煮3 h， 熬 汁600 mL， 合并黑豆汁共1 500 mL。 取何首乌饮片600 g， 用黑豆汁拌匀， 常压隔水蒸4 h， 晒干， 复蒸4 h， 晒干， 如此反复9 次。 每晒干1 次， 取50 g留样。

2.1.2 药典法炮制品 取何首乌饮片600 g， 照蒸制法（ 《中国药典》 通则0213） 加入黑豆汁拌匀后， 放入蒸柜蒸22 h， 经湖南中医药大学第一附属医院张志国教授等多位专家评定， 饮片内外均呈棕褐色， 符合药典描述， 再置于烘箱内80 ℃下烘干，即得。

2.2 方法学考察

2.2.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流动相乙腈（A）-0.01%磷酸（B），梯度洗脱， 程序见表1； 体积流量1.0 mL／min； 检测波长295 nm； 柱温30 ℃。 色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 溶液制备

2.2.2.1 对照品溶液 精密称取二苯乙烯苷、 大黄素、 大黄素甲醚、 大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、没食子酸、 5-羟甲基糠醛对照品适量， 甲醇溶解至刻度， 得质量浓度分别为0.35、 0.1、 0.05、 0.026、0.1、 0.042 mg／mL 的对照品溶液。

2.2.2.2 供试品溶液 精密称取样品0.5 g， 精密加入甲醇25 mL， 称定质量， 超声提取30 min， 甲醇补足减失的质量， 取续滤液， 过0.45 μm 微孔滤膜， 即得。

2.2.3 线性关系考察 分别吸取“2.2.2.1” 项下混合对照品溶液1、 2、 4、 6、 8、 10 μL， 在“2.2.1” 项色谱条件下进样， 以进样量为横坐标（X）， 峰面积为纵坐标（Y） 进行回归， 结果见表2， 表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.2.4 精密度试验 取“2.2.2.1” 项下对照品溶液， 在“2.2.1” 项色谱条件下进样6 次， 测得二苯乙烯苷、 大黄素、 大黄素甲醚、 大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、 没食子酸、 5-羟甲基糠醛峰面积RSD 分 别 为 0.65%、 1.35%、 0.82%、 2.01%、1.64%、 0.78%， 表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验 取“2.2.2.2” 项下供试品溶液， 于室温下0、 2、 4、 8、 10、 12、 24 h 在“2.2.1” 项色谱条件下进样， 测得二苯乙烯苷、大黄素、 大黄素甲醚、 大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、 没食子酸、 5-羟甲基糠醛峰面积RSD 分别为1.16%、 0.98%、 1.52%、 0.59%、 0.68%、 1.35%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.6 重复性试验 精密称取同一样品6 份， 按“2.2.2.2” 项 下 方 法 制 备 供 试 品 溶 液， 在“2.2.1” 项色谱条件下进样， 测得二苯乙烯苷、大黄素、 大黄素甲醚、 大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、 没食子酸、 5-羟甲基糠醛峰面积RSD 分别为0.75%、 0.88%、 1.26%、 1.48%、 0.81%、 1.89%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 加样回收率试验 精密称取含有量已知的样品6 份， 精密加入二苯乙烯苷、 大黄素、 大黄素甲醚、 大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、 没食子酸、 5-羟甲基糠醛对照品， 按“2.2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.2.1” 项色谱条件下进样， 计算回收率， 结果见表3。

2.3 样品含有量测定 将供试品溶液在“2.2.1”项色谱条件下进样， 计算含有量， 结果见表4。

3 讨论

3.1 炮制工艺参数选择 “九蒸九晒” 是何首乌古代传统的炮制方法， 宋代《本草图经》［8］首次记载“采时乘湿以布帛拭去土， 后用苦竹刀切， 米泔浸一宿， 曝干， 九蒸九曝， 乃可服”， 后世经过不断的发展一直沿用至近代。 中医理论认为， 黑色入肾经， 何首乌炮制辅料为黑豆， 蒸制时间要求多以“豆熟” “豆烂” 为度； 课题组前期实验证明，黑豆蒸制约2 h 即可达到“豆熟” 状态， 蒸制6 h即达到“豆烂” 程度； 本实验取中间值， 将何首乌拌黑豆汁蒸4 h， 晒干， 如此反复9 次。 对依据药典炮制方法生产的制首乌， 按实际生产情况结合药典中的成品性状描述， 确定连续蒸制22 h。

3.2 色谱条件选择 本实验考察了不同体积分数的甲醇分别采用超声、 加热回流进行提取， 结果表明以纯甲醇超声提取15 min 时， 6 种成分含有量较高。 同时， 考察了Agilent C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、 YWG-C18（250 mm×4.6 mm， 10 μm） 色谱柱的分离效果， 结果表明前者在分离效果和柱压方面都优于后者， 故选用Agilent C18色谱柱。 再考察了乙腈-水、 乙腈-0.01% 磷酸、 乙腈-0.05% 磷酸、 甲醇-水等流动相， 最终采用乙腈-0.01% 磷酸， 此时各成分的分离度良好， 峰形较佳。 另外，检测波长295 nm 时的色谱峰分离度优于270、280 nm， 柱温30 ℃时的优于25、 35 ℃。

3.3 不同炮制方法比较 何首乌炮制后二苯乙烯苷、 结合型蒽醌（大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷）含有量降低， 游离蒽醌（大黄素、 大黄素甲醚）、没食子酸含有量升高， 5-羟甲基糠醛为炮制后新产生成分， 在生品和一蒸、 二蒸品中未检出， 从三蒸三晒开始出现， 并随蒸晒次数的增加而增加， 除没食子酸外其余成分的含有量均与蒸晒次数及炮制时间呈正相关性； 依据药典制备的炮制品中各化学成分含有量相当于五蒸五晒品， 两者在炮制时间上也大致相同。 “九蒸九晒” 法中二苯乙烯苷含有量相当于药典法的49.8%， 游离蒽醌大黄素、 大黄素甲醚含有量比药典法高约30%， 结合型蒽醌大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷几乎检测不到， 没食子酸含有量与药典法相比差异不大。

表3 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents （n＝6）

表4 各成分含有量测定结果（mg／g， n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg／g， n＝3）

何首乌肝毒性可能与二苯乙烯苷与蒽醌类、 鞣质类成分相关［9］， 大剂量、 长期服用该成分可造成可逆性肝细胞损伤［10］。 结合蒽醌是游离蒽醌与苷以结合的形式存在， 在炮制过程中加热水解生成游离蒽醌和糖， 其泻下作用和肝毒性均大于游离蒽醌［11］， 因此化学成分不同是否与何首乌功效改变、毒性差异有相关性值得深入研究。 本实验可为为何首乌炮制工艺、 安全性评价与临床疗效的关系提供理论依据， 也能进一步保证该药材的临床安全用药。