大黄素-桂皮醛自微乳的制备及体外评价

马祖兵， 李小芳， 谢 龙， 赵甜甜， 孙 强， 唐海龙

（成都中医药大学药学院， 中药材标准化教育部重点实验室， 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地， 四川 成都611137）

药对是方剂组成的基本要素， 能较好地诠释中药复方“合群妙用” 的特点， 是单味中药与复方之间的桥梁， 构成了中药复方的核心［1］。 大黄-肉桂药对源自《医学衷中参西录》 中的秘红丹， 对肝郁多怒、 胃郁气逆致吐血、 衄血等症有一定治疗作用； 大黄配伍肉桂， 以肉桂辛热之性制大黄之苦寒峻下之势， 以大黄苦寒之性制肉桂辛热燥烈之弊， 两者配伍使用， 达到振脾阳、 通大便之功效［2］。 大黄素为大黄主要活性成分， 具有清除自由基、 抗癌等活性［3-4］； 桂皮醛为肉桂挥发油主要活性成分， 除具有传统的解热镇痛作用外， 对肿瘤、 糖尿病等也有治疗作用， 而且两者配伍具有抗肝癌作用［5-6］。

然而， 大黄素难溶于水， 口服溶出速度慢， 导致其生物利用度低， 限制了相关制剂开发与临床应用［7］。 自微乳是药物分散于一定比例的乳化剂、助乳化剂和油相后形成的制剂， 口服后能在胃肠道中与体液混合， 自发分散成粒径小于100 nm 的水包油型乳滴［8］， 能增加难溶性药物溶解能力， 促进药物淋巴转运及膜渗透， 减少首过效应， 被广泛应用于制剂研发中［9-10］。 本实验以大黄素为模型药物， 肉桂挥发油为油相， 制备大黄素-桂皮醛自微乳， 然后通过单纯形网格法优化处方， 以期增加大黄素溶解度， 为相关制剂开发奠定基础， 同时为中药挥发油应用于自微乳油相提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Aglient 1200 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）； Nicomp 380 ZLS 型激光粒度仪（美国PSS 公司）； 85-2 型恒温磁力搅拌器（常州澳华仪器有限公司）； 80-1 型离心沉淀器（江苏正基仪器有限公司）； FA224 型电子分析天平（万分之一， 上海舜宇恒平科学仪器有限公司）； RC-3 型溶出度测定仪（山东博科科学仪器有限公司）； XW-80A 型旋涡混合仪（海门市其林贝尔仪器有限公司）； Tecnai G2 型透射电子显微镜 （美国Fei公司）。

1.2 试药 大黄素原料药（西安小草生物植物科技有限责任公司， 批号 XC20161203， 含有量97%）； 大黄素对照品（成都曼思特生物科技有限公司， 批号MUST-16110712， 含有量99.48%）；肉桂油（广西贵港市陈桂堂）； 桂皮醛对照品（中国食品药品检定研究院， 批号110710-201720， 含有量98.4%）； 中链甘油三酸酯（铁岭北亚药用油有限公司）； 油酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司）； 二乙二醇单乙基醚（淮安市和元化工有限公司）； 聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40、 蓖麻油聚氧乙烯醚EL40 均购自山东优索化工科技有限公司； 吐温80、 吐温20、 油酸、 甘油、 乳化剂OP10、 聚乙二醇400、 1， 2-丙二醇均购自成都市科龙化工试剂厂。 乙腈、 磷酸均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 大黄素、 桂皮醛含有量测定

2.1.1 色谱条件［11］Capcell Pak C18色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流动相乙腈 （A） -0.1%磷酸（B）， 梯度洗脱（0 ～16 min， 75% B；16 ～20 min， 70% B； 20 ～30 min， 50% B； 30 ～40 min， 40%B； 40 ～50 min， 35%B； 50 ～60 min，75%B）； 体积流量1.0 mL／min； 检测波长265 nm；柱温30 ℃。 色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2 对照品溶液制备 分别精密称取桂皮醛、大黄素对照品13.6、 8.3 mg， 置于50 mL 量瓶中，甲醇溶解稀释， 分别配制成272、 166 μg／mL 贮备液， 各精密量取2 mL 混合， 甲醇定容于10 mL 量瓶中， 摇匀， 即得。

2.1.3 供试品溶液制备 精密量取自微乳适量，置于100 mL 量瓶中， 甲醇超声破乳溶解并定容，摇匀， 0.45 μm 微孔滤膜过滤， 取续滤液， 即得。

2.1.4 线性关系考察 分别取对照品溶液2.5、5、 10、 20、 30、 40、 50 μL， 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。 以进样量为横坐标（X）， 峰面积为纵坐标（Y） 进行回归， 得回归方程分别为大黄素Y＝3.153 7X＋35.736（R2＝0.999 0）， 线性范围83～1 660 ng； 桂皮醛Y＝3.734X＋3.672 6 （R2＝1）， 线性范围136～2 720 ng。

2.2 溶解度考察 精密称取油相（油酸、 油酸乙酯、 中链甘油三酸酯、 肉桂油）、 乳化剂（RH40、吐温80、 吐温20、 OP10、 EL40）、 助乳化剂（1，2-丙二醇、 聚乙二醇400、 二乙二醇单乙基醚、 丙三醇） 各4 g 于西林瓶中， 加入过量大黄素， 超声2 h 助溶， 37 ℃恒温水浴静置24 h 后， 4 000 r／min离心30 min， 取上清液适量， 甲醇稀释至一定倍数， 按“2.1” 项下方法测定， 结果见表1。 由表可知， 大黄素在各油相中的溶解度依次为肉桂油＞中链甘油三酸酯＞油酸乙酯＞油酸， 各乳化剂中的溶解度依次为RH40 ＞吐温80＞OP10＞EL40＞吐温20， 各助乳化剂中的溶解度依次为PEG-400＞1， 2-丙二醇＞甘油＞二乙二醇单乙基醚。

表1 大黄素溶解度测定结果（±s， n＝3）Tab.1 Results of solubility determination of emodin（±s， n＝3）

表1 大黄素溶解度测定结果（±s， n＝3）Tab.1 Results of solubility determination of emodin（±s， n＝3）

组成 辅料 溶解度／（mg·mL-1）油相 油酸 0.570±0.032油酸乙酯 1.924±0.072中链甘油三酸酯 2.590±0.054肉桂油 7.583±0.102乳化剂 RH40 0.792±0.062吐温80 0.612±0.045吐温20 —OP10 0.571±0.059 EL40 0.220±0.043助乳化剂 1，2-丙二醇 13.124±0.289聚乙二醇400 15.610±0.187二乙二醇单乙基醚 10.830±0.153丙三醇 11.824±0.165

2.3 处方优化

2.3.1 油相、 乳化剂筛选 选择肉桂油、 油酸乙酯、 中链甘油三酸酯、 油酸（油相）， 以及RH40、EL40、 吐温80、 吐温20、 OP10 （乳化剂） 进行考察， 将两者分别以1 ∶9、 2 ∶8、 3 ∶7、 4 ∶6 的比例加入西林瓶中旋涡振荡5 min 混合均匀， 称取0.1 g， 加37 ℃水稀释100 倍， 300 r／min 恒速磁力搅拌， 观察乳化情况， 并按目测评分标准［12］进行评价。结果， 肉桂油与RH40、 吐温80 按照1 ∶9、2 ∶8、 3 ∶7 比例配伍稀释后， 均形成澄清透明的乳化液， 而与吐温20、 EL40、 OP10 按各比例配伍稀释后均难以乳化， 形成白色絮状物； 油酸乙酯、油酸与各乳化剂按各比例配伍稀释后均难以乳化，导致液面有油层附着； 中链甘油三酸酯与RH40 按1 ∶9、 2 ∶8 比例配伍稀释后， 均形成澄清透明的乳化液。 结合表1 结果， 初步确定肉桂油、 中链甘油三酸酯作为油相， RH40、 吐温80 作为乳化剂。

2.3.2 助乳化剂筛选 将RH40、 吐温80 与各助乳化剂按1 ∶1 比例混合， 再将混合物与油相按4 ∶1比例混合， 旋涡振荡5 min 混合均匀， 称取0.1 g， 加37 ℃水稀释100 倍， 300 r／min 恒速磁力搅拌， 观察乳化时间。结果， 以1， 2-丙二醇为助乳化剂时， 肉桂油-RH40、 肉桂油-吐温80 组合乳化时间均优于其他助乳化剂与油相-乳化剂组合，故确定肉桂油作为油相， 1， 2-丙二醇作为助乳化剂， 同时因RH40、 吐温80 乳化效果接近， 故考虑将两者按一定比例混合作为乳化剂。

2.3.3 乳化剂比例筛选 将RH40 与吐温80 分别按10 ∶0、 9 ∶1、 8 ∶2、 7 ∶3、 6 ∶4、 5 ∶5、 4 ∶6、 3 ∶7、 2 ∶8、 1 ∶9、 0 ∶10 比例混合， 助乳化剂-混合乳化剂-油相以4 ∶4 ∶2 比例制备空白自微乳。 称取空白自微乳0.1 g， 加37 ℃水稀释100倍， 300 r／min 恒速磁力搅拌， 激光粒径仪测定空白自微乳液平均粒径和多分散指数（PDI）， 结果见图2。 由图可知， 混合乳化剂的乳化效果优于单一乳化剂， 而且当RH40 与吐温80 比例为6 ∶4 时作用最优。

图2 乳化剂比例对粒径和PDI 的影响Fig.2 Effects of emulsifier ratio on particle size and PDI

2.3.4 伪三元相图绘制 将RH40、 吐温80、RH40-吐温80 （6 ∶4） 与1， 2-丙二醇分别按9 ∶1、 8 ∶2、 7 ∶3、 6 ∶4、 5 ∶5、 4 ∶6、 3 ∶7、 2 ∶8、1 ∶9 比例混合， 再与肉桂油分别按9 ∶1、 8 ∶2、7 ∶3、 6 ∶4、 5 ∶5 比例旋涡振荡5 min 混合均匀，制备空白自微乳， 加 37 ℃水稀释 100 倍，300 r／min恒速磁力搅拌， 记录各相形成微乳的比例， 通过Origin 8.5 软件绘制油相-乳化剂-助乳化剂伪三元相图， 结果见图3。 由图可知， 混合乳化剂形成的微乳面积大于单一乳化剂， 由阴影面积区可得肉桂油、 RH40-吐温80 （6 ∶4）、 1， 2-丙二醇比例分别为10% ～40%、 10% ～85%、 10% ～75%。

图3 RH40、 吐温80 伪三元相图Fig.3 Pseudo-ternary phase diagrams for RH40 and Tween80

2.4 单纯形网格法优化 将肉桂油、 RH40-吐温80 （6 ∶4）、 1， 2 丙二醇的总量定为100%， 根据伪三元相图结合各相实际配伍特点， 确定各相质量比例范围分别为肉桂油10% ～40%、 RH40-吐温80（6 ∶4） 30% ～60%、 1， 2-丙二醇30% ～60%， 将以上三相按单纯形网格法试验设计比例加入西林瓶中， 旋涡振荡5 min 混合均匀， 加入过量大黄素混合均匀， 超声助溶2 h 后于37 ℃水浴静置24 h 以达到溶解平衡， 取上清液， 即得载药自微乳。 取自微乳0.5 g， 加入37 ℃水稀释100 倍， 磁力搅拌至完全乳化， 激光粒径仪测定自微乳平均粒径和PDI； 再精密称取自微乳0.1 g 于10 mL 量瓶中，37 ℃水定容振荡， 使其形成乳化液， 4 000 r／min离心30 min， 移取上清液适量， 甲醇稀释至一定倍数， 按“2.1” 项下方法测定载药量， 以肉桂油（A）、 RH40-吐温80 （6 ∶4） （B）、 1， 2 丙二醇（C） 用量为影响因素， 平均粒径 （Y1）、 PDI（Y2）、 大黄素载药量（Y3） 为评价指标优化处方，结果见表2。

表2 试验设计及结果Tab.2 Design and results of tests

通过Design Expert 8.06 软件进行拟合， 得到回归方程分别为Y1＝-13.489 09A-3.481 44B-5.747 53C＋0.526 8AB＋0.775 35AC＋0.191 03BC-0.019 968ABC （R2＝0.999 7，＝0.999 5）、Y2＝0.039 249A＋0.012 406B＋0.024 99C-1.367 63×10-3AB-1.628 79×10-3AC-8.509 13×10-4BC ＋5.706 85×10-5ABC （R2＝0.984 1，＝0.970 5）、Y3＝-2.451 03A-0.584 32B-0.717 94C＋0.091 511 AB＋0.070 170AC＋0.035 233BC-2.240 74×10-3ABC（R2＝0.997 3，＝0.994 9）， 上述方程P 均＜0.000 1， 模型水平非常显著； 失拟项P 均＞0.05，相对于纯误差水平不显著； R2、均＞0.95， 表明模型拟合度较好， 具有代表性， 能客观准确地根据自变量变化情况进行预测［12］。 响应面分析见图4。

图4 各因素响应面图Fig.4 Response surface plots for various factors

参考文献［13］， 以大黄素载药量越大， 粒径、 PDI 越小为优化指标， 通过Design Expert 8.0.6 软件预测最佳油相-乳化剂-助乳化剂比例，确定最优处方为肉桂油用量10%， RH40-吐温80（6 ∶4） 用量60%， 1， 2-丙二醇用量30%。 然后，根据上述最优处方制备3 份自微乳进行验证试验，结果见表3， 可知实际值与预测值相当， 所建模型预测性良好。

表3 显示， 最优处方对大黄素的饱和载药量为17.73 mg／g， 但大黄素加入量过大时， 加水稀释形成微乳后静置一段时间会有药物结晶析出， 使其粒径和PDI 变大， 其原因可能是载药量过大时大黄素结晶析出， 自微乳体系难以形成稳定的界面膜，从而影响平均粒径和PDI［13］， 故考虑适当减少原料药加入。 最终确定， 自微乳制备方法为精密称取肉桂油2.0 g、 RH40-吐温80 （6 ∶4） 12.0 g、 1，2-丙二醇6.0 g， 置于50 mL 烧杯中， 37 ℃水浴下300 r／min 恒速磁力搅拌10 min 混合均匀， 加入0.35 g 大黄素， 磁力搅拌15 min 后超声助溶1 h，即得。

表3 验证试验结果（n＝3）Tab.3 Results of verification tests （n＝3）

2.5 体外评价

2.5.1 外观 在低温（4 ℃） 下， 自微乳较黏稠，不透明， 并呈深红色； 在室温（25 ℃） 下， 自微乳流动性较好， 澄清透明。 将自微乳浓缩液用蒸馏水稀释100 倍后， 可得澄清透明的黄色溶液。

2.5.2 形态 取自微乳适量， 加入37 ℃蒸馏水稀释100 倍， 取适量滴加到200 目铜网表面， 滤纸吸取多余液体， 2%磷钨酸溶液负染色2 min， 滤纸吸取多余液体， 自然晾干， 在透射电镜（TEM） 下观察， 结果见图5。 由图可知， 自微乳经蒸馏水稀释后呈圆球形， 大小均匀， 乳滴之间无粘连， 粒径大小在30 nm 以下。

图5 自微乳TEM 图Fig.5 TEM images for self-microemulsions

2.5.3 粒径、 PDI、 Zeta 电位 自微乳加水稀释100 倍后， 测得平均粒径为 （17.5±0.41） nm，PDI 为0.083±0.02， Zeta 电位为（-12.71±0.06）mV， 表明所得自微乳粒径较小， 分布较窄， 体系较稳定。

2.5.4 载药量 精密称取自微乳0.1 g （M1）， 置于10 mL 量瓶中， 37 ℃水定容， 振荡使其形成乳化液， 4 000 r／min 离心30 min， 移取上清液适量，甲醇稀释至一定倍数， 按“2.1” 项下方法测定含有量， 计算载药量（M2／M1）， 测得大黄素、 桂皮醛载药量分别为（16.66±0.29）、 （91.36±0.48）mg／g。

2.5.5 溶出度［7］精密称取含大黄素50.0 mg 的原料药和自微乳， 装于胶囊壳中， 根据2015 年版《中国药典》 溶出度测定法第二法（篮法） 测定，以900 mL 水为溶出介质， 设定转速100 r／min， 温度（37.0±0.5）℃， 分别于3、 6、 9、 15、 20、 30、40、 50、 60、 90、 120 min 取样， 每次2 mL， 同时补足等温等体积溶出介质， 溶液经0.45 μm 微孔滤膜滤过， 按“2.1” 项下方法测定大黄素含有量， 绘制溶出曲线， 见图6。 由图可知， 大黄素原料药在120 min 内累积溶出度小于10%， 而自微乳中其累积溶出度在20 min 已达96.87%， 表明自微乳可有效提高大黄素在水中的溶出速率。

图6 大黄素溶出曲线Fig.6 Dissolution curves for emodin

3 讨论

本实验发现， 大黄素在肉桂油中的溶解度较大， 为肉桂油作为大黄素-桂皮醛自微乳油相提供了可能性， 而且肉桂油主要成分桂皮醛相当分子质量较小， 仅为132.15， 有报道［14］小分子油相能较容易地嵌入到表面活性剂中， 与乳化剂形成界面膜， 增溶能力好于大分子油相。 油相与乳化剂的配伍结果表明， RH40 和吐温80 对肉桂油的乳化效果均较好， 其中前者具有抑制P-糖蛋白对药物外排或抑制肠细胞色素P450 对药物催化的作用， 故还能增加药物的膜渗透性［15］， 但它在常温下为凝固态， 使用不方便， 故考虑将其与后者按照6 ∶4的比例混合作为乳化剂。 通过考察混合乳化剂对自微乳粒径和PDI 的影响， 同时比较混合乳化剂和单一乳化剂自微乳面积区域大小， 可较全面地证明混合乳化剂乳化效果优于单一乳化剂， 其原因可能是混合乳化剂可有效改善单一乳化剂用量多、 乳化时间长等缺点， 从而提高体系稳定性、 载药量等［16］。

然后， 本实验采用单纯形网格法优化大黄素-桂皮醛自微乳处方， 相较于目前广泛应用的正交试验及星点设计-效应面法［17-18］， 该方法具有试验次数少、 预测准确的优点， 能客观明确地分析非线性条件下总量恒定、 相互影响的油相-乳化剂-助乳化剂与指标之间的关系［19］。 考虑到载药量过大时会引起药物析出， 从而影响自微乳平均粒径和PDI，故适当减少大黄素加入量， 最终制得平均粒径较小、 分布较窄、 体系较稳定的自微乳， 并可显著改善难溶性成分大黄素的溶解度。

“药辅合一” 思想是中药制剂辅料选择的重要原则， 也是不同于西药制剂的显著特征， 在中药制剂中具有普遍性［20］。 本实验将大黄-肉桂药对中的肉桂油既作为自微乳中的油相又作为药物， 体现了该思想， 同时为自微乳在含有挥发油、 难溶性成分中药药对中的应用提供了新思路。 今后， 将重点研究大黄其他成分与肉桂有效成分配伍制备自微乳，并将桂皮醛载药量作为处方优化的评价指标。