不同混合溶剂对丹参酮ⅡA-PLGA 微球的影响

周苗苗， 张 霞， 李治芳， 王文苹，2，3∗

（1. 宁夏医科大学药学院， 宁夏 银川750004； 2. 宁夏回药现代化工程技术研究中心， 宁夏 银川750004；3. 回医药现代化教育部重点实验室， 宁夏 银川750004）

作为制备载药缓释微球最常用的方法， 乳化-溶剂挥发法工艺过程中因所用溶剂理化性质、 移除速率的差异， 可影响微球形态、 粒径、 释药速率等性能［1］。 其中， 二氯甲烷是制备微球最常用的有机溶剂， 当与其他溶剂混合制备微球时， 可与药物、 载体、 内外相间产生相互作用， 进而影响载药微球性能， 故考察溶剂体系与微球常规性能之间的相关性具有重要意义。

丹参酮ⅡA是丹参中提取得到的脂溶性菲醌类化合物， 对冠心病、 心绞痛、 心律失常等疗效显著， 临床应用广泛［2］， 该成分微溶或部分溶于水［3］， 自身具有荧光特性［4］， 有利于在激光共聚焦显微镜下直接观测药物分布特征。 因此， 本实验以其为模型药物， 采用二氯甲烷及其混合溶剂体系制备丹参酮ⅡA-PLGA 微球， 通过荧光分析考察混合溶剂对微球中药物分布的影响， 并尝试将溶剂特征与微球性能相关联。

1 材料

PL203 电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］； QL-861 涡旋仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）； T10BS25 均质机（德国IKA 公司）； DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）； FD-1C 冷冻干燥机（北京德天佑仪器有限公司）； THI-100 恒温培养摇床（上海一恒科学仪器有限公司）； Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）； Microtrac X-100 粒径测定仪（美国霍尼韦尔公司）； FV1000-IX81 激光扫描共聚焦显微镜 （日本Olympus公司）。

丹参酮ⅡA（南京景竹生物科技有限公司， 批号JZ2015082403）。 聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA） （90 kDa， 50／50， 山东省医疗器械研究所，批号16030206）； 聚乙烯醇1788 型［阿拉丁试剂（上海） 有限公司， 批号G1509033］。 二氯甲烷、乙酸乙酯、 丙酮、 二氧六环、 乙腈为色谱纯（美国Fisher 公司）； 其他试剂均为分析纯； 水为纯化水（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 丹参酮ⅡA平衡溶解度测定 分别取0.5 mL不同溶剂至离心管中， 加丹参酮ⅡA至过饱和， 置于恒温气浴摇床（25 ℃， 100 r／min） 中平衡48 h，8 000 r／min 离心5 min 后吸取上清液， 加甲醇稀释一定倍数。 采用HPLC 法测定［5］［柱温30 ℃； 检测波长270 nm； 流动相甲醇-水（93 ∶7）； 体积流量1.0 mL／min］， 以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归， 得回归方程为Y＝0.018X - 0.157 （ R2＝0.999 9）， 在 1 ～250 μg／mL范围内线性关系良好， 再计算丹参酮ⅡA平衡溶解度， 并查阅相关文献获取溶剂的沸点、 黏度等有关参数［6］， 结果见表1。

表1 丹参酮ⅡA 平衡溶解度测定结果（±s， n＝3）Tab.1 Results of equilibrium solubility determination of tanshinoneⅡA （±s， n＝3）

表1 丹参酮ⅡA 平衡溶解度测定结果（±s， n＝3）Tab.1 Results of equilibrium solubility determination of tanshinoneⅡA （±s， n＝3）

溶剂 沸点（101.3 kPa）／℃ 黏度（20 ℃）／（mPa·s）极性 平衡溶解度／（g·100 mL-1）二氯甲烷 40 0.43 3.4 6.67±0.25二氧六环 101 1.54 4.8 1.30±0.03乙酸乙酯 77 0.45 4.3 0.35±0.01丙酮 56 0.32 5.4 0.44±0.02乙腈 81 0.36 5.8 0.20±0.01

2.2 微球制备 精密称取PLGA 270 mg、 丹参酮ⅡA30 mg， 加入2 mL 混合溶剂， 涡旋溶解。 将上述溶液加到40 mL 聚乙烯醇（2%） 溶液中均质剪切（8 000 r／min） 0.5 min 制备O／W 初乳， 转入800 mL 聚乙烯醇（1%） 溶液中， 40 ℃下磁力搅拌3 h， 离心（3 000 r／min） 2 min 后收集微球，冷冻干燥， 即得。

2.3 载药量、 包封率测定 精密称取微球粉末10 mg， 加入0.3 mL 二氧六环溶解， 再加入适量甲醇至5 mL 量瓶中定容， 超声30 min， 再离心（12 000 r／min） 5 min 取上清液， 按“2.1” 项下方法测定丹参酮ⅡA含有量， 计算载药量、 包封率， 公式分别为载药量＝ （微球中药物含有量／微球质量） ×100%、 包封率＝ （微球中药物含有量／投药量） ×100%， 结果见表2。 由表可知， 当微球理论载药量为10%时， 不同溶剂体系所得微球的包封率均约为90%， 表明O／W 法制备微球过程中药物损失少， 这与丹参酮ⅡA水溶性较低有关； 二氯甲烷-丙酮载药量和包封率最高， 并与二氯甲烷-乙酸乙酯比较有显著差异（P＜0.05）， 这是由于丙酮能与水混溶， 并较其他3 种溶剂沸点更低， 能迅速扩散至外水相中， 使PLGA 快速沉积， 从而阻碍了药物扩散损失［7］。

2.4 粒径测定 取微球粉末约30 mg， 均匀分散于10 mL 0.5%聚乙烯醇溶液（含0.1%聚山梨酯-80） 中， 超声10 min 后取适量混悬液， 采用粒径测定仪测定， 结果见表2。 由表可知， 二氯甲烷与不同溶剂混合后制得微球的粒径均约40 μm， 差异较小， 其原因可能是二氯甲烷所占溶剂比例大、 挥发快， 是影响微球成形的主要溶剂［8］。

表2 微球性能考察结果（±s， n＝3）Tab.2 Results of performance investigation of microspheres （±s， n＝3）

表2 微球性能考察结果（±s， n＝3）Tab.2 Results of performance investigation of microspheres （±s， n＝3）

注：与二氯甲烷-丙酮（2 ∶1）比较，∗P＜0.05

溶剂 固含物／% 载药量／% 包封率／% 粒径／μm二氯甲烷-二氧六环（2 ∶1）15 9.26±0.11 92.56±1.12 41.68±24.89二氯甲烷-乙酸乙酯（2 ∶1）15 8.95±0.35∗ 89.48±3.48∗ 39.98±21.84二氯甲烷-丙酮（2 ∶1）15 9.80±0.12 98.01±1.18 38.72±22.60二氯甲烷-乙腈（2 ∶1）15 9.40±0.32 93.95±3.17 37.12±26.28

2.5 体外释药行为 精密称取微球粉末10.0 mg，分散于10 mL pH 7.4 磷酸盐缓冲液（含2%聚山梨酯-20） 中［5］， 置于恒温气浴摇床上（120 r／min、37 ℃）， 分别于4 h 及3、 8、 18、 28、 38、 48、58、 68、 78、 88、 98 d 离心（3 000 r／min） 2 min，定量取上清液， 同时补充同温等量缓冲液， HPLC法测定丹参酮ⅡA累积释放量， 绘制体外释放曲线， 结果见图1。

图1 微球体外释放曲线Fig.1 In vitro release curves for microspheres

由图可知， 不同混合溶剂中微球均呈现明显缓释效果， 突释率均较低（4 h 释放率约5%）， 28 ～68 d 释药速率明显加快， 98 d 后基本完成释药行为； 二氯甲烷-二氧六环释放最快， 可能是由于二氧六环沸点高， 固化过程中易残留， 在微球冷冻干燥过程中形成微孔通道， 有利于释放介质渗入； 丙酮沸点低， 溶剂扩散速率快， 使得微球快速固化，表面较致密， 故二氯甲烷-丙酮释放速率最低［9］。再采用方差分析进行组间相似性判定［10］， 发现二氯甲烷-二氧六环与二氯甲烷-乙酸乙酯、 二氯甲烷-乙酸乙酯与二氯甲烷-乙腈、 二氯甲烷-丙酮与二氯甲烷-乙腈之间的释放行为无显著差异， 其余各组之间有显著差异。 最终， 测得释放量在25% ～40%之间， 这可能是由于丹参酮ⅡA外部环境影响所致［3］， 随着含水量增加及空气（氧气） 存在， 使得释放介质中该成分发生部分降解［11］。

2.6 药物分布相关参数测定［12］采用激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）， 取3 ～5 mg 微球于5 mL 离心管中， 加50 μL 纯水振荡1 min 使其分散均匀，吸取适量置于载玻片上， 将盖玻片缓慢盖于液滴上， 用封片剂封片， 543 nm 波长下观察并拍摄各体系载药微球， 结果见图2。 由图可知， 不同混合溶剂中微球荧光分布均由边缘向中心减弱， 表明丹参酮ⅡA在微球固化过程中随溶剂挥发而向外迁移， 最终趋于微球表面分布。

图2 微球CLSM 图Fig.2 CLSM images for microspheres

以二氯甲烷-二氧六环为例， 所得CLSM 图在ImageJ-win32 软件中将荧光强度转换为数值信号，通过Origin 8.0 软件绘制荧光强度-微球半径图， 所得曲线沿X 轴中心点对折。 在Analysis 模块下， 曲线进行多项式回归处理使其平滑， X、 Y 轴同时统一为100%； 截取从原点开始5%的Y 轴， 找到对应X 轴的坐标（图3A）； Y 轴上余下的95%曲线进行Log10 回归后曲线拟合， 得到曲线方程及斜率（图3B）。 其中， 图3A 中原点到5%Y 轴与所对应的X 轴为曲线平缓区， 其半径比代表药物在球心分布的比例， 其值越大， 代表药物在球心部分分布越多， 而上升区为剩余95% Y 轴与对应的X 轴，并呈逐渐增加的趋势， 表明趋于微球表面药物分布越多［13］； 图3B 中对数处理后的曲线与一元一次方程拟合度较高（R2＝0.99）， 方程斜率表示微球固化过程中药物在微球表面扩散的速度， 斜率越大，表明药物向微球边缘扩散越快。 再比较各体系曲线拟合参数， 结果见表3。

图3 CLSM 图数据处理Fig.3 Data processing of CLSM images

表3 微球曲线拟合参数Tab.3 Curve fitting parameters for microspheres

由表可知， 各体系微球平缓区半径比及上升区斜率从F1 到F4 逐渐增加， 呈正比关系。 联合表1发现， 混合溶剂随着其极性增加， 平缓区半径比及上升区斜率提高， 这是由于二氯甲烷中引入极性较大（水溶性较大） 的乙酸乙酯、 二氧六环、 丙酮、乙腈， 虽然沸点高于二氯甲烷， 但它们可显著增加混合溶剂在第二相中的溶解度， 在形成O／W 初乳后可较快地被萃取或扩散至水相中。 因此， 在该溶剂中溶解度较好的丹参酮ⅡA易随溶剂扩散至微球表面， 并发生沉积［14］。

2.7 微球性能与溶剂性质的相关性 通过SPSS 17.0 软件， 对突释量［15］、 包封率、 上升区斜率，以及各溶剂沸点、 极性、 黏度、 饱和溶解度进行相关性回归分析， 结果见图4。 由图可知， 药物突释量与其在溶剂中的平衡溶解度、 溶剂黏度呈正相关关系， 如药物二氧六环中溶解性最好， 导致微球在固化过程中随着溶剂挥发更易将药物带到表面， 使其突释增加， 结合图2 可知药物更趋向表面分布［12］； 微球包封率、 上升区斜率与溶剂极性呈正相关关系， 表明溶剂极性是固化过程中影响药物迁移速率的主要因素［16］； 包封率与溶剂沸点成反比，溶剂沸点越高， 则其在微球固化过程中不易除去，导致药物突释增加［17］； 除二氯甲烷以外的溶剂改变了体系黏度， 黏度越大， PLGA 越易沉积， 进一步阻碍药物向外迁移， 故斜率与溶剂黏度呈负相关关系。

图4 微球性能与溶剂性质的相关性分析Fig.4 Correlation analysis of microsphere performance and solvent properties

3 讨论

本实验采用O／W 法制备丹参酮ⅡA-PLGA 微球， 体外释放结果表明， PLGA 在40 d 左右降解，释放98 d 后残余微球中丹参酮ⅡA很少， 几乎可忽略不计。 由此推测， 累积释药率较低的主要原因可能是该成分从微球释放至介质中后， 在水性环境和光热作用下发生一定程度的降解［3，11］。

微球的粒径、 载药量、 包封率、 体外释放是评价制剂的重要指标， 在乳化-溶剂挥发法制备微球过程中， 通常选用沸点低、 易挥发的有机溶剂， 如二氯甲烷、 乙酸乙酯等。 作为乳液法制备微球的“隐形” 因素， 溶剂主要发挥溶解聚合物与药物、影响微球固化过程、 形成特定形态表面或内部结构的微球等作用［18］。

迄今已有许多文献报道了溶剂在微球领域的应用， 主要可分为以下几类： （1） 溶剂影响微球的分布， 不同溶剂具有不同物理性质（如黏度、 表面张力、 水中溶解度、 蒸气压等） 及对药物、 载体材料的溶解能力， 这些都将直接影响微球粒径、载药量、 包封率， 从而影响微球稳定性、 体外释放等［19］； （2） 溶剂可制备安全性更高的载药微球，评价微球性能优劣的参数之一为终产物溶剂残留量， 乳液法所用的有机溶剂具有一定毒性， 而且该方法制备微球时溶剂易残留， 故选用毒性较小的溶液制备PLGA 微球， 并通过溶剂萃取使其残留量减少， 可提高微球的生物安全性［20］； （3） 溶剂可用于制备功能型PLGA 微球， 沸点低、 与水相容性好的单一溶剂与混合溶剂可制备外观形态不同的多孔、 中空型PLGA 微球， 进而影响微球性能［21］。本实验发现， 溶剂在乳液法制备微球过程中具有重要作用， 不同溶剂制得微球的药物分布差异较大，但影响其形成及性能的机制有待系统深入的研究。

4 结论

本实验通过O／W 法制备丹参酮ⅡA-PLGA 微球， 考察混合溶剂性质对微球性能的影响， 并将两者进行关联分析， 发现尽管混合溶剂均以二氯甲烷为主， 但其对微球仍有较大影响（主要涉及载药量、 体外释放、 药物分布等）， 而且其特性与溶剂特征参数之间具有显著相关性。 综上所述， 研究可为微球成形及其调控机制的研究奠定基础， 有利于优化处方工艺， 并更好地调节微球载药、 释药行为。