中药中蒽醌类的肝毒性及其分离分析技术研究进展

韩继丽，胡倩倩，崔 霞，王格格，傅 强(西安交通大学药学院，西安 710061)

蒽醌类化合物是何首乌(Polygonummultiflorum)、番泻叶(Foliumsennae)、决明子(CatsiatoraL.)、大黄(RheumpalmatumL.)、芦荟(Aloevera(Haw.) Berg)等多种常用中药的主要活性成分，主要用于抗肿瘤、泻下、抗菌、抗氧化、利尿和止血等[1]。蒽醌类化合物在天然药物中主要以游离态形式和与糖成苷的结合态形式共同存在，在体内常以与葡萄糖成苷的形式存在[2]。蒽醌类化合物中最重要的生物活性成分为大黄素(emodin)、大黄酚(chrysophanol)、芦荟大黄素(aloe-emodin)、大黄酸(rhein)和大黄素甲醚(physcion)[3]。对含有蒽醌类化合物的体内外样品的分离分析方法主要有薄层色谱法[4]、分光光度法[5]、高效液相色谱法(HPLC)[6]、胶束电动色谱法[7]和毛细管电泳法[8]等。蒽醌类化合物的基本结构见图1。

图1 蒽醌类化合物的基本结构

1 蒽醌类化合物的肝毒性研究概况

目前报道的导致肝毒性的含蒽醌类中药主要集中在何首乌，何首乌产生肝毒性与其含有蒽醌类成分有关[9]。关于何首乌等以蒽醌类化合物为主要活性成分的中药导致肝毒性的具体机制目前尚未明确，国内外研究人员进行了大量与何首乌诱导的肝损伤相关实验，为理解其毒性产生机制提供参考，见表1。此外，也有研究报道了其他以蒽醌类化合物为主要成分的中药产生肝毒性，见表2。

表1 何首乌中主要蒽醌类成分的肝毒性

表2 蒽醌类化合物的肝毒性与致癌性

研究者利用高内涵检测法检测蒽醌类化合物对正常人源肝细胞HepaRG的细胞毒性，并对其进行了DNA损伤分析，结果显示，所研究的大黄酸等4种大黄蒽醌类化合物均可不同程度地对肝细胞产生毒性[10]。含有蒽醌类化合物中药所致肝毒性的机制可能有以下几种：①蒽醌类成分具有类似肾上腺皮质激素样作用，在一定浓度范围内能抑制肝细胞的生长，导致肝细胞凋亡[11]；②蒽醌类化合物在体内代谢过程中产生某种肝毒性物质，引起肝细胞脂质过氧化导致肝细胞坏死[12]；③蒽醌类化合物或其代谢产物影响胆汁酸转运体与代谢酶的功能和表达，使肝细胞正常的结构和代谢功能发生异常[13]；④由于人肝脏代谢酶遗传具有多态性，部分人体内存在先天肝脏代谢酶缺陷，在服用含有蒽醌类化合物及其制剂后，药物会在代谢和生物转化过程中蓄积致毒；⑤对蒽醌类化合物过敏的人群一旦服用此类药物则易发生超敏反应从而损害肝脏；⑥导致蒽醌类成分产生肝细胞毒性的可能分子机制之一为氧化应激损伤，如大黄素甲醚会显著升高活性氧和导致线粒体损伤，芦荟大黄素产生肝毒性则主要表现为对肝细胞游离Ca2+水平的调控作用[10]。

2 蒽醌类化合物的检测方法与问题

2.1HPLC法 HPLC法在蒽醌类化合物的分离分析中发挥着重要作用[31]。由于蒽醌类化合物的母核具有共轭结构，可采用紫外-可见分光光度法(UV)进行检测。目前常采用高效液相色谱-紫外可见分光光度法(HPLC-UV)对蒽醌类化合物进行定性定量分析[32-33]，结果表明，HPLC-UV法检测灵敏度与样品前处理方式相关性很大。对于蒽醌类化合物的提取分离方法主要是pH梯度萃取法[34]与超声辅助萃取法[35]。近年来，越来越多的研究者开始采用分散液相微萃取法(DLME)[36]、离子液体盐诱导液-液萃取法(IL-SI-LLE)[37]和固相萃取(SPE)法[38]等样品前处理方法，建立了可用于蒽醌类化合物体内外样品提取、纯化的新方法。有研究者将微波辅助离子液体均相液液微萃取与高效液相色谱-二极管阵列检测技术结合，用于药用植物中蒽醌类化合物的测定[39]。Hu K等[40]建立了以双(四氧环[2]芳烃[2]三嗪)改性硅胶为固相吸附剂同时测定人尿中5种痕量蒽醌类化合物的超高效液相色谱法，检测限可达到3.9×10-9～5.7×10-9g·mL-1。殷召军[41]建立了以离子液包裹的四氧化三铁作为吸附剂的磁性固相萃取法，并将其用于富集检测大黄中蒽醌类成分。Wu X Q等[42]将选择性加速溶剂萃取法与超高效液相色谱法结合，可有效分离蒽醌类化合物并同时快速测定蒽醌类化合物。

Liu Y等[43]将超高效液相色谱法与电喷雾电离轨道阱质谱法联合，分离鉴定了大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷等5种蒽醌类化合物，该方法的检测限可达到1×10-10g·mL-1。目前关于蒽醌类化合物导致肝毒性的具体毒性成分、特定化学结构、剂量均未阐明，联用技术必定在今后成为此类化合物分析的重要手段。HPLC法被广泛用于中药材及中药制剂中蒽醌类化合物的含量测定、限量检查及系统的方法学研究中，能较客观地反映供试样品中蒽醌类化合物的状况[44]。但在实际应用中还存在一些问题，对高效液相色谱提出了新的挑战。比如：①中成药样品、保健品和生物血浆样品中蒽醌类化合物的含量较低，且样品成分复杂，干扰较大；②样品的制备方法及前处理方法会显著影响蒽醌类化合物的含量测定结果；③同时分析样品中多个蒽醌类化合物时，分析时间很长；④由于中草药样品中存在种类繁多且浓度差异很大的物质，通常很难实现分析物与样品基质的基线分离；⑤液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)法灵敏度高、重复性好，但仪器价格昂贵，限制了其广泛应用。

表3 HPLC法在蒽醌类化合物分离分析中的应用

2.2毛细管电泳法(CE) CE法又被称为高效毛细管电泳或毛细管电分离法，样品前处理更为简便，分析效率更高，因此其在蒽醌类化合物的分离分析中也有较多发展。大部分研究集中于改善毛细管色谱的缓冲液体系，以达到更好的分离效率。WANG De-Xian等[51]以四丁基溴化铵的乙腈溶液作为非水相介质，显著提高蒽醌类化合物的分离效率。对于蒽醌类化合物的毛细管电泳检测一般也采用紫外检测法，也有研究者采用毛细管电泳安培检测法对蒽醌类化合物同时进行分离与检测[52]。

对于成分复杂的中药复方制剂，采用HPLC法测定往往会污染色谱柱，导致柱效降低。而毛细管柱易冲洗再生，但是毛细管电泳存在重复性较差、线性范围窄、灵敏度低和尚无专属的监测器。将CE与其他技术如流动注射进样[53]、质谱[54]和核磁共振技术[55]联用，以及不同电泳技术之间的联用, 可快速完成众多复杂成分的分离与结构鉴定，使CE的应用范围扩大，从而弥补该技术的一些缺陷。

表4 CE在蒽醌类化合物分离分析中的应用

2.3分光光度法 分光光度法因具有设备简单、操作方便等优点被广泛用于蒽醌类化合物样品的分析。主要采用UV、近红外光谱法(NIRS)以及荧光分光光度法。

蒽醌化合物可与镁离子发生配位反应生成在505 nm波长处有最大吸收的配合物，潘小红等[61]利用此性质测定了保健食品中蒽醌类化合物的总量。吴利敏等[62]利用NIRS法对虎杖中蒽醌类化合物进行定量分析，结果表明，NIRS法准确度较高，且能满足虎杖中多组分同时测定的精密度要求。部分蒽醌类化合物在有机溶剂中还具有荧光特性, 因此也可采用荧光分光光度法对其进行测定[63]。杨黎燕等[64]基于蒽醌类化合物在丙酮溶液中具有较强荧光的原理，建立了测定中药中蒽醌类化合物的荧光分光光度法, 结果显示，蒽醌类化合物的荧光强度与其质量浓度在0.4～50 μg·mL-1范围内具有良好的线性关系。

分光光度法的测定结果影响因素较多，一般只能测得一类物质的总含量。对于紫外分光光度法，仅含有α-酚羟基或邻位二酚羟基的蒽醌类化合物才可与镁离子络合从而使吸收峰位发生红移，不具有这2种结构的蒽醌类化合物无法被检测到，因此相应的测定值偏小。荧光分析只适用于本身具有荧光或者可以衍生/淬灭荧光的化合物，在应用范围上有一定的限制。

2.4核磁共振波谱法(NMR) NMR法被分析的质子引起共振的综合强度与产生共振的质子数和分析物的浓度成正比。与传统的色谱定量方法相比，核磁共振氢谱(1HNMR)更适合于同时鉴定和定量复杂基质中的生物成分。

1HNMR在中药中生物活性成分的含量测定方面应用越来越多。王志伟等[65]建立了测定何首乌及其炮制品中大黄素和大黄素甲醚含量的氢核磁定量方法，该方法测试溶剂为氘代二甲基亚砜，内标物为顺丁烯二酸，定量目标信号为大黄素的H-7、大黄素甲醚的H-7，测定结果与HPLC-UV法测定结果基本一致。一种快速测定大黄中5种活性游离蒽醌的1HNMR法利用大黄特征信号可准确定量大黄中5种蒽醌类化合物[66]。

2.5流动注射化学发光分析法 化学发光分析法作为一种微量和痕量技术通常难以保证样品与发光试剂快速、高度重现地混合。而流动注射作为一种可实现自动化进样和分离富集的技术，可与多种化学分析手段联用。流动注射-蒽醌抑制化学发光法基于蒽醌类化合物在碱性溶液中对次氯酸钠-鲁米诺等化学发光体系有显著抑制作用,且抑制程度与蒽醌类化合物浓度呈线性关系，从而实现对蒽醌类化合物的快速准确检测。屈颖娟等[67]提出了可直接测定蒽醌类化合物的流动注射化学发光分析新方法，检出限为2×10-9g·mL-1。目前，限制该方法广泛应用的主要原因是其选择性较差。

2.6其他方法 蒽醌类化合物的测定方法多样，除以上方法外，高速逆流色谱法无需固体分离介质，故克服了因使用常规固相载体而引起样品吸附损耗的不足，且制备量大，分离效率高，溶剂用量少，因此在蒽醌类化合物分离分析中应用逐渐增多[68-70]；极谱法(Polarography)具有操作简便、快速、灵敏和选择性好的优点，在测定一些蒽醌类化合物的含量方面具有一定优越性[71]；超临界流体色谱法在此类化合物的分析中具有很好的应用前景[72]。电化学分析方法灵敏度高、选择性好、响应时间短和操作简便，有研究者制备石墨烯/聚多巴胺/金(GNs/PDA/Au)复合纳米材料并将其应用于构建电化学传感器从而对大黄素进行检测，建立的方法检测限为5.0 μmol·L-1[73]。

3 小结与展望

目前，关于蒽醌类化合物产生肝脏不良反应的文献多集中于几种特定的蒽醌类化合物，而对其他蒽醌类化合物研究较少。目前对含有蒽醌类化合物的中药发挥诸多药理作用的研究仍以其中所含多类化学成分协同作用为主，对此类药物的特定药用成分研究将成为今后研究的重点。目前仍然需要开发更为简单、可靠和廉价的方法来分析药用植物及其制剂中的蒽醌类化合物，采用对环境无害的方法和低成本的原料，开发高效率、高收率和高选择性的技术以分离工业和药理学上重要的蒽醌类化合物。此外，随着新型分离分析技术的进步，进一步完善蒽醌类化合物的测定方法，使测定的指标成分与药理活性密切关联。