反胶束体系中脂肪酶催化合成单月桂酸甘油酯

张桂菊，王肖彦，王 瑞，陈芳莉，徐宝财

(北京工商大学 食品学院，北京市食品风味化学重点实验室，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048)

单脂肪酸甘油酯具有良好的乳化、分散、抑菌等作用，被广泛应用于食品、化妆品、医药等领域[1-4]。与传统的化学合成法相比，酶法合成单脂肪酸甘油酯具有反应条件温和、耗能低、产品安全性高、无污染等优点[5]。但是，在低温条件下亲脂性的反应底物(如油脂、三脂肪酸甘油酯等)与亲水性的反应底物甘油的混溶性差，导致酶法合成单脂肪酸甘油酯的反应效率较低[6]。查宝萍等[7]在无溶剂体系中采用固定化脂肪酶催化椰子油制备单月桂酸甘油酯，在最佳反应条件下所得混合脂肪酸甘油酯中单月桂酸甘油酯含量仅为30%左右。因此，采用适宜的反应体系对于酶催化制备单脂肪酸甘油酯具有至关重要的作用。通过加入有机溶剂，可以增加底物溶解度、提高反应物的混溶性，从而加快反应速率并提高反应物的转化率。但是，有机溶剂可能会使脂肪酶变性失活，影响其催化活性和稳定性[8]。超临界CO2、离子液体等也可作为酶催化制备单脂肪酸甘油酯的反应媒介，但是成本较高[9]。相对而言，反胶束体系易于制备、价格较为低廉，对亲水和亲油底物均具有良好的增溶性，有利于催化反应的进行，具有良好的应用前景。Itabaiana等[10]采用硬脂酸与丙酮缩甘油在AOT/异辛烷反胶束体系中进行脂肪酶催化酯化反应制备单硬脂酸甘油酯，反应仅30 min产率即可达80%。Park等[11]研究发现，羧酸酯酶在AOT/异辛烷反胶束体系中，催化活性最高，最优条件下催化癸酸与甘油进行酯化反应制备1-单癸酸甘油酯产率可达80%以上。

本文研究了AOT/异辛烷反胶束体系的黏度及增溶水量等特性，同时考察了反应时间、AOT质量浓度、含水量、脂肪酶浓度、缓冲液pH、底物摩尔比等因素对脂肪酶催化合成单月桂酸甘油酯的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

三月桂酸甘油酯(纯度>96%)，单月桂酸甘油酯、双月桂酸甘油酯(纯度>99%，Sigma-Aldrich公司)；AOT(纯度≥97%)，异辛烷(分析纯)，甘油(99.5%)，乙腈、丙酮(色谱纯)，卡尔费休试剂(分析纯)，奶酪香精脂肪酶(酶活力20 000 IU/g，丹麦诺维信生物技术有限公司)。

IS-RSV1立式恒温振荡器，Agilent1200高效液相色谱(安捷伦科技有限公司)，BSA423S电子天平，乌式毛细管黏度计，WS-6型微量水分测定仪。

1.2 实验方法

1.2.1 AOT/异辛烷反胶束溶液的配制

将适量AOT溶于异辛烷中，配成一定浓度的AOT/异辛烷溶液。称取适量奶酪香精脂肪酶于磷酸盐缓冲液中，用微量注射器将含酶缓冲液注入到AOT/异辛烷溶液中，振荡混合至溶液澄清，即得含酶的AOT/异辛烷反胶束溶液。

1.2.2 反胶束溶液黏度的测定

移取10 mL纯溶剂异辛烷至乌氏黏度计中，恒温10 min，测定纯溶剂的流过时间。另移取10 mL反胶束溶液于乌氏黏度计中，测定反胶束溶液的流过时间。

根据Poiseuille方程，反胶束溶液和纯溶剂的黏度η和η0可以按方程式(1)和(2)进行计算：

η=kρt

(1)

η0=kρt0

(2)

式中：t、t0分别为反胶束溶液和纯溶剂的流过时间，s；k为黏度计常数，0.014 17 mm2/s2；ρ为纯溶剂的密度，0.69 g/cm3。

相对黏度：ηr=η/η0

(3)

增比黏度：ηsp=(η-η0)/η0=ηr-1

(4)

1.2.3 Karl-Fischer法测定反胶束体系的增溶水量(W0)

在滴定瓶中加入一定量无水甲醇，用Karl-Fischer 试剂将甲醇中水分滴去，然后用微量进样器准确向甲醇溶液加入10 μL蒸馏水，再用Karl-Fischer 试剂将溶液滴定至终点。从水分滴定仪上读取所消耗溶液量，得出Karl-Fischer试剂相应系数。

用微量进样器准确取反胶束溶液50 μL，迅速加入无水甲醇溶液中，用Karl-Fischer试剂将其滴定至终点，从水分滴定仪上准确读取所消耗Karl-Fischer试剂体积，计算反胶束体系中增溶水的物质的量。

反胶束溶液中W0计算：

W0=反胶束增溶水的物质的量/反胶束体系中表面活性剂的物质的量

(5)

1.2.4 反胶束“水池”直径的计算

根据Kinugasa等[12]的研究，“水池”直径dwp满足以下公式：

dwp=0.25W0+1.14

(8)

1.2.5 反胶束体系中酶催化合成单月桂酸甘油酯

向反胶束体系中加入1 g三月桂酸甘油酯和一定量的甘油(甘油已采用4 Å型分子筛除水)置于立式恒温振荡器，在一定的条件下进行反应，定时取样进行液相色谱分析。

1.2.6 定量分析单月桂酸甘油酯含量

采用高效液相色谱-示差折光检测器(HPLC-RID)进行定量分析。分析条件：进样量20 μL，流动相为乙腈-丙酮(1∶1)，流动相流速1 mL/min，柱温35℃，检测器温度40℃。

定量分析方法采用外标法。分别配制不同质量浓度的三月桂酸甘油酯、双月桂酸甘油酯和单月桂酸甘油酯溶液，溶剂为乙腈-丙酮(体积比1∶1)，进行液相色谱分析。以质量浓度为横坐标，液相色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。通过线性拟合得到：单月桂酸甘油酯标准曲线方程为y=-13 378.090 32+145 361.690 32x(R2=0.998 57)；双月桂酸甘油酯标准曲线方程为y=10 643.812 1+142 003.302 9x(R2=0.997 88)；三月桂酸甘油酯标准曲线方程为y=47 708.012 9+139 361.428 2x(R2=0.998 57)。

2 结果与讨论

2.1 不同含水量AOT反胶束体系的W0与黏度

在反胶束体系AOT质量浓度0.06 g/mL、缓冲液pH 7.5、脂肪酶用量50 mg/mL时，改变反胶束体系的含水量，研究不同含水量对反胶束体系的W0、“水池”直径及黏度等特性的影响，结果见表1。

表1 不同含水量的AOT反胶束体系的W0与黏度

由表1可以看出，随着含水量的增大，反胶束体系的W0随之增大，“水池”直径随着W0的增大而逐渐增大，“水池”溶解极性物质的能力也随之增大，反胶束基团聚集数增多。反胶束的W0是决定反胶束结构及物理性质的重要物理参数，反胶束的“水池”直径与其含水量成正比。因此，W0本身也反映了反胶束的大小[13]。当含水量达到0.09 mL/mL后，体系变浑浊，W0变化缓慢，说明加水达到一定程度后，“水池”中的水已经达到饱和状态，若加水量过大，将会增强水与界面的相互作用，破坏反胶束溶液结构，导致反胶束出现分相现象，不利于反应的进行。因此，含水量范围确定为0.02～0.09 mL/mL。

AOT反胶束溶液黏度随含水量增大先增加后降低。当含水量增大时，表面活性剂极性基头与水分子的水化作用加强，会形成更多的聚集数，胶束之间的相互作用增强，黏度随之增高[14]。反胶束不是刚性球体，当含水量达到0.09 mL/mL后，“水池”的形状可能从球形或近球形到柱形之间变化，不同的形状会导致胶束聚集数的变化，从而引起黏度改变[15]。

2.2 不同质量浓度AOT反胶束体系的W0与黏度

在反胶束体系含水量0.05 mL/mL、缓冲液pH 7.5、脂肪酶用量50 mg/mL时，改变AOT的添加量，研究不同AOT质量浓度对反胶束体系的W0、“水池”直径及黏度等特性的影响，结果见表2。

表2 不同AOT质量浓度的反胶束体系的W0与黏度

由表2可以看出，随着AOT质量浓度的增加，W0、“水池”直径及黏度也增加。这是因为表面活性剂的极性基头与水分子强烈的水化作用，会形成较多的聚集束，胶束之间的相互作用增强，而黏度也会随之增加。因此，表面活性剂的质量浓度会影响反胶束体系的黏度以及“水池”的直径。

2.3 反胶束体系单月桂酸甘油酯合成单因素实验

2.3.1 反应时间的影响

在反应温度55℃、振荡器转速180 r/min、底物摩尔比4∶1、含水量0.05 mL/mL、磷酸盐缓冲液pH 7、AOT质量浓度0.1 g/mL、脂肪酶用量60 mg/mL时，考察反应时间对反应的影响，结果如图1所示。

图1 反应时间对反应的影响

从图1可以看出，随着反应时间的延长，单月桂酸甘油酯的质量分数增加，在反应时间达到10 h后，三月桂酸甘油酯、单月桂酸甘油酯和双月桂酸甘油酯质量分数基本不变，反应达到平衡。综合考虑，确定较优的反应时间为10 h。

2.3.2 缓冲液pH对反应的影响

在反应温度55℃、振荡器转速180 r/min、反应时间10 h、底物摩尔比4∶1、含水量0.05 mL/mL、脂肪酶用量60 mg/mL、AOT质量浓度0.1 g/mL时，考察缓冲液pH对反应的影响，结果如图2所示。

图2 缓冲液pH对反应的影响

酶分子上有很多酸性、碱性氨基酸的侧链基团，其随着pH的变化处于不同的解离状态，直接影响与底物的结合和进一步的反应，从而影响酶的活性[16]。即体系pH的改变将引起酶构象的改变，进而影响酶的催化能力。在阴离子表面活性剂AOT反胶束体系中，酶则依靠疏水作用到达油水界面，而且pH过高时带负电荷的酶甚至会与阴离子表面活性剂产生较强的静电排斥，导致酶在油水界面上的浓度迅速降低，从而对反应结果造成影响[17]。由图2可知，随着缓冲液pH的增加，单月桂酸甘油酯的质量分数升高，缓冲液pH为7.5时达到83.4%，缓冲液pH超过7.5后，单月桂酸甘油酯的质量分数降低。因此，采用pH为7.5的磷酸盐缓冲液。

2.3.3 脂肪酶用量对反应的影响

在反应温度55℃、振荡器转速180 r/min、反应时间10 h、底物摩尔比4∶1、含水量0.05 mL/mL、磷酸盐缓冲液pH 7.5、AOT质量浓度0.1 g/mL时，考察脂肪酶用量对反应的影响，结果如图3所示。

图3 脂肪酶用量对反应的影响

从图3可以看出，随着脂肪酶用量的增加，单月桂酸甘油酯的质量分数不断增加，在50 mg/mL时达到最大，为83.4%，当脂肪酶用量超过50 mg/mL之后，对单月桂酸甘油酯的质量分数影响较小。这可能是由于在催化剂用量较少时，底物相对于酶较为充足，酶被充分利用，故单月桂酸甘油酯的质量分数随着脂肪酶用量的增加而增加；当脂肪酶用量增加到一定程度时，酶相对于底物而言已经过剩，对反应的影响较小[18]。因此，选择脂肪酶用量为50 mg/mL。

2.3.4 底物摩尔比对反应的影响

在反应温度55℃、振荡器转速180 r/min、反应时间10 h、含水量0.05 mg/mL、磷酸盐缓冲液pH 7.5、AOT质量浓度0.1 g/mL、脂肪酶用量50 mg/mL时，考察底物摩尔比对反应的影响，结果如图4所示。

图4 底物摩尔比对反应的影响

由图4可知，当甘油与三月桂酸甘油酯的摩尔比为1∶1时，单月桂酸甘油酯的质量分数为53.6%，增加体系中甘油的量，有利于反应的进行。当底物摩尔比为3∶1时，单月桂酸甘油酯的质量分数为82.5%。底物摩尔比增加至4∶1时，单月桂酸甘油酯的质量分数达到83.3%，再继续增大甘油的量，单月桂酸甘油酯的质量分数不断降低。原因可能是在一定范围内，增加反应物甘油的量有利于反应向正反应方向进行，超过一定量时，过量的甘油包覆在脂肪酶表面导致其失活[19]。从经济性的角度考虑，较优底物摩尔比为3∶1。

2.3.5 含水量对反应的影响

在反应温度55℃、振荡器转速180 r/min、反应时间10 h、底物摩尔比3∶1、磷酸盐缓冲液pH 7.5、AOT质量浓度0.1 g/mL、脂肪酶用量50 mg/mL时，考察含水量对反应的影响，结果如图5所示。

图5 含水量对反应的影响

由图5可知，反应体系含水量低，反胶束“水池”中的绝大部分水与表面活性剂结合，用于反胶束的构成而保持反胶束中酶活性构象所需的自由水减少，影响酶活力的提高[20]，且形成的反胶束的尺寸不能完全包含酶分子，导致酶的活力不高，随着含水量的增大，维持酶构象的自由水增多，酶的活性增大，在含水量为0.05 mL/mL时达到最佳，当含水量大于0.05 mL/mL时，随着含水量的增大，不仅使油水界面减小，而且可能导致酶的结构过于松弛，柔性过大，影响酶活力的发挥。另外，含水量过大将使反应向反方向移动，不利于单脂肪酸甘油酯的生成。因此，最佳含水量为0.05 mL/mL。

2.3.6 AOT质量浓度对反应的影响

在反应温度55℃、振荡器转速180 r/min、反应时间10 h、底物摩尔比3∶1、含水量0.05 mL/mL、磷酸盐缓冲液pH 7.5、脂肪酶用量50 mg/mL时，考察AOT质量浓度对反应的影响，结果如图6所示。

图6 AOT质量浓度对反应的影响

表面活性剂(AOT)质量浓度关系到反胶束的形成和酶的催化活性，AOT质量浓度太低，无法形成反胶束溶液，而AOT质量浓度太高，对脂肪酶有毒害作用，抑制酶的活性[21]。由图6可知，随着AOT质量浓度的增加，单月桂酸甘油酯的质量分数不断增加，当AOT质量浓度为0.1 g/mL时，单月桂酸甘油酯质量分数最高，为84.2%。继续增加AOT质量浓度，由于对脂肪酶催化活性的抑制作用，单月桂酸甘油酯的质量分数开始下降。因此，最佳AOT质量浓度为0.1 g/mL。

在上述优化的工艺条件(反应时间10 h，缓冲液pH 7.5，脂肪酶用量50 mg/mL，底物摩尔比3∶1，含水量0.05 mL/mL，AOT质量浓度0.1 g/mL)以及反应温度55℃、振荡器转速180 r/min下，重复3次验证实验，反应体系单月桂酸甘油酯的质量分数为84.4%。

2.4 反胶束体系特性与酶催化反应结果的相关性

反胶束酶催化反应体系是一个热力学动态平衡的体系，酶分子在反胶束中所处的位置取决于酶自身的亲水/疏水特性。脂肪酶具有油/水界面亲和力，一般位于油水界面的内表面或者疏水尾链区域[22]，如图7所示。

图7 反胶束脂肪酶催化反应示意图

对于脂肪酶催化三月桂酸甘油酯与甘油进行甘油解反应而言，亲水性的底物甘油可溶于反胶束体系的纳米水核，而亲脂性的底物三月桂酸甘油酯溶于有机溶剂或附着于油水界面的表面活性剂膜上，底物与酶分子在油/水界面接触并发生催化反应。由于反胶束均为纳米尺度，具有非常大的界面积，从而加快酶催化反应的速度。

增溶水量(W0)是表征反胶束微聚集体大小的基本特性参数之一，而体系黏度对于酶催化反应的传质作用具有非常重要的影响，因此结合2.1、2.2以及2.3.5、2.3.6部分的实验数据，分析了反胶束体系增溶水量和相对黏度与酶催化反应体系中单月桂酸甘油酯质量分数的相关性。

当含水量为0.02～0.07 mL/mL时，W0随着含水量的增加而线性增加，之后W0增速减缓，当含水量增加至0.08 mL/mL后W0变化不大。当含水量为0.02～0.05 mL/mL时，体系相对黏度随着含水量的增加而显著增加，当含水量增加至0.05 mL/mL后体系相对黏度变化较小。当AOT质量浓度为0.02～0.10 g/mL时，W0随着AOT质量浓度增加而线性增加，之后增速减缓。反胶束体系的黏度随着AOT质量浓度(0.02～0.16 g/mL)增加而线性增加。由图5、图6可知，酶催化反应体系中单月桂酸甘油酯的质量分数随着含水量、AOT质量浓度的增加先增大后减小，当含水量为0.05 mL/mL、AOT质量浓度为0.1 g/mL时，单月桂酸甘油酯的质量分数最大。

综合上述结果可知，当AOT质量浓度和含水量较小时，随着AOT质量浓度、含水量的增加，W0增加，反胶束体系增溶底物的量增加，且体系黏度较小，因此促进了酶催化反应的进行。但是当AOT质量浓度和含水量增加到一定程度之后，W0继续增加，虽然增溶底物的量增加，但是反胶束的尺寸也随之增加，从而油/水界面积减小，同时体系黏度的增加影响了底物与脂肪酶之间的传质作用，因此不利于酶催化反应的进行。另外，如前所述，反胶束体系中的水及AOT对酶的结构和活性都有一定的影响，反胶束体系对于酶催化反应的影响机制非常复杂，还有待深入研究。

3 结 论

AOT/异辛烷反胶束体系中，采用三月桂酸甘油酯与甘油进行脂肪酶催化甘油解反应制备单月桂酸甘油酯，通过单因素实验对合成工艺进行优化，得到最佳工艺条件为：反应温度55℃，振荡器转速180 r/min，AOT质量浓度0.1 g/mL，含水量0.05 mL/mL，脂肪酶用量50 mg/mL，缓冲液pH 7.5，底物摩尔比(甘油与三月桂酸甘油酯摩尔比)3∶1，反应时间10 h。在最佳条件下，反应体系中单月桂酸甘油酯的质量分数为84.4%。通过对AOT反胶束体系的一些基本特性的研究，对脂肪酶催化甘油解制备单脂肪酸甘油酯反应条件的选择提供参考。同时对于反胶束体系增溶水量及体系黏度与酶催化反应结果的相关性进行了分析，但是对于反胶束体系的基本特性对酶催化反应的影响机制还有待深入研究。