microRNA对动物生殖轴以及胚胎着床影响的研究进展

向光明，刘秋月，王翔宇，狄 冉，胡文萍，曾宪垠，曹晓涵*，储明星*

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.四川农业大学生命科学学院，四川雅安 625014）

microRNA（miRNA）是一类小的非编码RNA，长度一般为22 nt，可以通过与靶基因mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR）结合，在转录后的水平上对靶基因进行调控[1-4]。在人类基因组中，超过1/3的基因受miRNA调控，而且它广泛参与生物体内各种生理及病理过程，很多特异的miRNA参与生物钟的调控[5]。已有大量研究表明，miRNA对哺乳动物繁殖有重要作用[6-7]。哺乳动物的繁殖受下丘脑-垂体-性腺轴（Hypothalamic-Pituitary-Gonad Axis，HPGA）调控，而miRNA在HPGA相关的组织中广泛表达，部分表达量还较高。现有的研究显示，miRNA很可能通过对HPGA轴的表观调控来影响哺乳动物的繁殖性能[8-10]。另外，胚胎着床也是影响哺乳动物繁殖的一个重要因素，miRNA也参与胚胎着床过程[11-12]。本文主要针对miRNA在哺乳动物繁殖相关组织中的表达及作用和miRNA对胚胎着床的影响进行综述。

1 miRNA的生成/加工过程

关于miRNA的研究开始于1993年，最初有2个研究团队同时在小杆线虫胚胎发育后期分别发现lin-4基因编码的小RNA产物—lin-4可以调节lin-14的转录[13]。直到2000年，Reinhart等[14]又在线虫中发现了另一个调节性的小RNA—let-7，同样可以抑制其他基因的表达。后来在植物和动物中发现越来越多的小的非编码RNA发挥着与lin-4和let-7相似的功能，它们被称为miRNAs。miRNA的形成首先需要在细胞核内形成初级miRNA，初级miRNA在Drosha酶剪切下形成前体miRNA。形成的miRNA前体首先通过Exportin5蛋白运输到细胞质中，在Dicer酶（双链RNA专一性RNA内切酶）的作用下被剪切成21～25个核苷酸长度的双链miRNA（dsRNA）[15]。然后dsRNA结合到AGO蛋白上形成RNA诱导的基因沉默复合物（RNA-induced Silencing Complex，RISC），其中1条在RISC上形成成熟的miRNA，最后结合到靶基因mRNA的3'-UTR，从而调节靶基因mRNA的翻译和降解，另一条则被降解[16]。miRNA发挥作用时，一般先形成pre-mRNA再通过胞外分泌方式到达靶器官或靶细胞，加工形成成熟的miRNA，再发挥作用[1]。

2 miRNA在哺乳动物生殖轴的表达及其调控功能

miRNA作为表观调控因子，广泛参与了机体内各种生理及病理过程，而哺乳动物的繁殖性状是机体内分子调控最为复杂和重要的性状之一，机体主要通过HPGA轴来对哺乳动物繁殖能力进行调节。大量研究表明，miRNA在哺乳动物发情启动、激素分泌、卵泡发育、精子形成以及胚胎着床等环节都存在严密的分子调控。如图1所示，在HPGA轴每个组织中都存在已知的miRNA发挥调节功能。已有文献支持的miRNAs调节HPGA轴的分子通路以及具体影响的繁殖功能见表1。下面将针对miRNA在哺乳动物繁殖轴以及繁殖过程中不同环节中的调控作用展开综述。

图1 miRNA在HPGA中的组织表达

2.1 miRNA在下丘脑中的表达及其对GnRH功能的影响 在哺乳动物中，下丘脑神经元分泌GnRH作用于垂体，垂体分泌的FSH和LH作用于性腺，从而影响哺乳动物的繁殖性能。研究表明，miRNA参与调控哺乳动物的繁殖过程，如在LbT2小鼠的促性腺细胞系中发现GnRH可以诱导miR-132和miR-122的表达上调[17]，而miR-132和miR-122又可以通过SIRT1-FOXO1通路调控GnRH诱导的FSHβ的表达[18]。GnRH可以通过NSun2通路下调miR-125b，从而促进FSH和LH的分泌；而miR-132可以抑制NSun2的活性，从而上调miR-125b，维持miR-125b表达水平的稳定，进而对于GnRH的活性及调控功能产生影响，而在很多神经疾病中这2个miRNAs异常表达也证实了这一点[19]。

表1 哺乳动物中miRNA的组织表达、分子通路和功能

GnRH对于青春期和成年哺乳动物的繁殖力有着重要作用。Ojeda等[20]研究发现，青春期之前，GnRH上升的同时miRNAs的表达也发生明显变化，进一步在小鼠中研究发现“GnRH开关”可以控制幼儿期到少年期的转化，而miR-200和miR-153是这个开关的重要组成部分，阻止miRNA的合成会导致小鼠不育。在GnRH神经元中，miRNA可以靶及GnRH启动子的阻遏物Zeb1和Cebpb，从而维持GnRH的正常表达，启动青春期，而干扰这个过程就会打断神经内分泌对生殖的调控[2]。在新生儿期大鼠下丘脑的Lin28/let-7表达上调，而在幼儿期到青春期下调[43]。在猴子中，Lin28在青春期之前也显著降低，Lin28b/let-7通路打乱会导致青春期的延迟，说明下丘脑中Lin28/let-7的表达控制着青春期的启动[21]。从以上研究可以看出，miRNA可以与下丘脑神经分泌的GnRH相互作用，进而影响FSH和LH的分泌以及哺乳动物青春期的启动，最终影响哺乳动物的繁殖能力。

2.2 miRNA在垂体的表达及对FSH和LH分泌的影响垂体位于颅中窝，蝶骨体上的垂体窝内，是身体内最复杂的内分泌腺，控制着其他性腺的功能，也被称为“主腺体”，可分为腺垂体和神经垂体。腺垂体包含5种不同的细胞，分别分泌不同的激素，而性腺细胞是其中的一种，分泌FSH和LH[44]。Yuan等[22]研究miR-375和miR-7在繁殖相关组织表达时，发现它们在腺垂体的表达量最高，而且进一步证实了miR-375与骨形成蛋白受体2（BMPR2）结合，miR-7则与前列腺素F2受体调控子结合，从而参与对生殖功能的调控；还有研究表明miRNA参与了垂体的发育，如在敲除Dicer小鼠的模型中，发现垂体生长缓慢、前叶分支异常及各种激素分泌异常等[45]。进一步研究发现，miR-26b通过抑制Lef-1的表达调节Pit-1表达，促进了垂体前叶细胞向Pit-1细胞系分化[23]；miR-7a2在垂体中高表达，抑制了高尔基体糖蛋白1（GLG1）及下游的BMP4通路，同时也降低前列腺素F2a负调控因子（PTGFRN）的表达，而PTGFRN则可以抑制前列腺素通路和FSH及LH分泌，这说明miR-7a2对垂体发育和繁殖有重要调控作用[24]。

最近很多研究发现，miRNA控制着促性腺激素（FSH和LH）的分泌。如Ye等[25]用GnRH处理猪垂体前叶细胞6 h后，发现FSH的表达显著上升，同时细胞中有21种miRNAs上调和10种miRNAs下调；进一步分析发现，其中10种上调和3种下调的miRNAs可以与FSHb 3'UTR结合，包括miR-361-3p，它的上调抑制了FSH的分泌。Han等[3]在大鼠的垂体前叶细胞中发现miR-186-5p也可以靶向结合FSHb 3'UTR，从而调节FSH的分泌。在大鼠的垂体细胞中抑制miR-212和miR-312表达实验中，发现由GnRH诱导的FSH的分泌下降，并没有发现FSHb的mRNA表达，进一步实验验证了GnRH诱导FSHb的分泌必须依靠miR-212和 miR-312（还与 SIRT1/FOXO1通路有关）[18]，这也直接表明miRNA对GnRH调控促性腺细胞基因表达起着重要作用。在单层垂体前叶细胞中研究尿皮素（Ucn2）对LH分泌抑制机制时，发现Ucn2可以诱导miR-325-3p上调表达，而且上调的miR-325-3p又进一步抑制了LH的翻译和分泌[26]。而Hidetoshi等[27]也发现，miR-200b和miR-429对雌鼠的排卵起着重要作用；进一步研究发现在miR-200b和miR-429的双敲除的小鼠中，它们的靶基因Zeb1上调，从而抑制了LH的分泌，导致雌鼠的不育，这些都表明miRNA哺乳动物的生殖起着重要作用。这些垂体特异表达的miRNAs，能够通过影响垂体中性腺细胞FSH和LH的分泌，进一步对哺乳动物的繁殖功能进行间接调控。

2.3 miRNA在卵巢的表达及对卵泡发育的影响 近些年来，关于小RNA在卵巢的研究越来越多，它们广泛参与卵巢的基础功能。在卵巢表达的小RNA中，miRNAs的表达最多，而这些高表达的miRNAs中，如let-7家族、miR-21、miR-99a等的表达量是最丰富的[28-29]。Di等[30]在滩羊和小尾寒羊卵巢中发现了483个miRNAs，属于183个家族，且繁殖季节3个时期在卵巢中有25个显著差异的miRNAs表达（其中有19个上调、6个下调），通过KEGG通路分析，很多miRNAs参与与生殖激素相关的通路（如类固醇合成、雌雄激素代谢、GnRH通路等）及卵泡/黄体发育的相关通路。Zhai等[31]也在繁殖季节发情和非繁殖季节发情的哈萨克绵羊的卵巢中发现，差异表达的miRNAs有48个，而这些差异表达miRNA的靶基因主要参与繁殖相关激素通路和卵泡发育，推测这些miRNA很可能与季节性发情调控有关。另外，Yang等[46]在研究营养条件对哈萨克绵羊提前由发情间期向发情期转化的机制时，通过高通量测序和建miRNA库发现，在绵羊卵巢营养加强型组中miRNA库中有294个miRNAs，而在营养较低的组中miRNA库中有307个miRNAs，进一步分析加强营养导致发情期提前的原因可能是营养加强导致卵巢miRNAs的差异表达，使其靶基因（TTLL11、SARDH、FOXRED1等）活化，引起甲基转移酵素（GNMT）的表达，从而改变叶酸的代谢，最后影响TSH-DIO2/DIO3-TH-GnRH这一通路诱导母羊发情提前。而Yang等[47]也发现，不同营养水平中卵巢中有113个差异表达的miRNAs，进一步研究发现miR-200b和其靶基因GNAQ可能构成一个重要的负反馈调节圈，参与营养水平对季节性繁殖的影响。

卵泡是雌性生殖的重要功能单元，在相关旁分泌内分泌因子及基因的调控下，卵泡发生了一系列生理活动，如卵泡生长成熟、卵泡闭锁、排卵等，而miRNA在这个过程中发挥着重要功能。Ⅲ型核酸酶Dicer是miRNA合成的关键酶。已有研究表明，在卵母细胞和受精卵中Dicer酶的转录水平是普通组织或细胞的10～15倍[48]。在小鼠卵巢粒层细胞中敲减Dicer，虽然增加了原始卵泡量，但加快了早期卵泡的募集，导致更多的卵泡退化。而且与未敲除Dicer的野生型小鼠相比，与卵泡发育相关的基因（如Amh、Inhba、Cyp17a1等）的表达差异显著[49]；还有研究通过miRNA深度测序发现，在形成优势卵泡过程中有15种异常调节的miRNAs，且其中10种是在优势卵泡中特异表达[29]。在猪的卵巢中，用微芯片检测卵泡闭锁的不同阶段miRNAs的表达时，发现共有1 133个miRNAs表达，这些miRNAs在闭锁阶段的卵泡中表达最多，在健康和闭锁早期的卵泡中表达较低，而且在3种卵泡中差异表达的miRNAs有200种，其中有23种在健康卵泡与早期闭锁卵泡差异表达[32,50]，说明它们很可能与卵泡闭锁的启动有关。而Xu等[33]研究发现，TGF-β1在10 ng/mL对牛粒层细胞增殖能产生明显的抑制作用，进而通过高通量测序发现，有无用10 ng/mL TGF-β1处理牛粒层细胞2组之间有很多差异表达的miRNA，它们可能参与Wnt、MAPK和TGF-β等信号转导通路，而这些对卵泡的发育起着重要作用。粒层细胞是卵泡的重要组成部分，对卵泡发育和排卵都有重要影响，miRNA对卵泡细胞起着调控作用。Liu等[34]通过双荧光报告系统发现，miR-26b可以靶向SMAD4的3'UTR抑制猪的粒层细胞增殖；Cao等[35]在猪的细胞中发现Let-7g可以靶向MAP3K1诱导其凋亡；Yao等[51]也在牛的粒层细胞中发现miR-125b可以靶向BMPR1B，抑制粒层细胞的增殖。这些研究也表明miRNA可以通过调控影响粒层细胞增殖的基因，从而影响哺乳动物的繁殖能力。

很多miRNAs在卵巢中广泛表达。目前研究发现，卵巢中miRNA一方面对季节性发情性状有影响，另一方面对卵泡的发育起着重要调控作用，更多功能亟待挖掘。

2.4 miRNA在睾丸中的表达及对精子形成的影响 精子形成是一个发生在睾丸曲细精管中生殖细胞分化的过程，是雄性动物生育能力的决定性因素，它包含3个连续的过程：先由精原细胞进行有丝分裂和分化形成初级精母细胞，接着初级精母细胞减数分裂形成单倍体精细胞，最终转变成精子。然而成功的精子形成不仅需要时空上准确的基因表达，而且受转录、转录后水平及表观遗传的调控[52-53]。miRNA作为一类新型的转录后水平调控子，对精子形成起着重要调控作用。有研究通过转录组数据等方法分析发现，在精子发生过程中miRNA的表达呈现细胞特异性或阶段特异性，如有些miRNAs特异地在精细胞中表达，有的则在睾丸的其他细胞中广泛表达[54-55]。在小鼠模型中研究miRNA对精子形成的影响时，条件性地敲除生殖细胞的Dicer基因，发现精子形成过程异常，如减数分裂过程中精母细胞的凋亡显著增加、圆形精子数量减少和很多精子的形态发生缺陷等[56]。在单倍体精子细胞删除Dicer基因导致精细胞和精子长度的异常，导致的表型变化并没有在精原细胞中敲除Dicer基因的影响大[57]，从而表明越早敲除Dicer基因，就会对精子形成表型变化产生更加严重的影响。

SSCs是未分化的精原细胞，它能够维持不断的自我更新和分化成精原细胞产生精子，即精子形成取决于精原细胞、精原干细胞的稳定和分化[36]。很多研究表明miRNA有利于维持SSCs量的稳定。在小鼠的SSCs细胞中发现优势表达的miRNAs有miR-20、miR-21和miR-106等[4]，并且发现，miR-21、miR-106通过靶及STAT3和Ccnd1在转录后的水平对小鼠SSCs的自我更新进行调控[37]。在山羊中研究发现miRNA-204可以通过靶向Sirt，从而调节SSCs的增殖[38]，而miRNA-34c则通过p53通路调节SSCs细胞凋亡[39]。还有一些miRNAs与SSCs的分化有关，如miR-17-92和miR-106b-25家族在视黄酸（RA）诱导精子形成过程中下调，并且在成年小鼠睾丸细胞特异性中敲除miR-17-92家族，导致了小鼠的SSCs、精原细胞减少，精子形成过程受损[40]。

精子形成需要睾丸支持细胞的支持。已有研究表明在支持细胞中miRNA的表达丰富[41]，如miR-133b可以通过靶向GLI3介导周期蛋白B1和D1来促进支持细胞的增殖，miR-762通过环指蛋白4（NFP4）促进了猪未成熟支持细胞的生长[42,58]等，这些都说明了miRNA参与了对精子形成的调控。

可知在睾丸中广泛表达的miRNAs中，很多miRNAs的表达在精子形成过程中呈现细胞特异性或阶段特异性，这些miRNAs通过细胞增殖或凋亡通路影响精子形成过程中不同阶段细胞（如精原干细胞和支持细胞）的数量，控制正常精子的生成质量，从而对雄性的生殖能力进行调控。

3 miRNA对哺乳动物胚胎着床的影响

胚胎着床（Implantation）失败是妊娠初期和辅助生殖一个主要的限制因素，严重影响了哺乳动物的繁殖能力。胚胎着床的决定因素主要包括胚胎的生存能力、着床时期（接受期）和胚胎母体之间的交流3个方面。目前，很多研究表明miRNA作为表观调控因子参与了对胚胎着床的调控[47,59]。

研究表明，在小鼠的卵母细胞及胚胎着床早期miRNA的功能被抑制，直到二细胞之后才被重新活化[60-61]。敲除miRNA合成的关键酶Dicer和AGO2同样会导致原肠胚死亡[62-63]。还有研究发现miR-29b可能通过调节甲基转移酶DNMT3a/b的表达导致DNA甲基化的破坏，从而导致小鼠早期胚胎发育阻滞[64]。在牛体外受精的桑椹胚和囊胚阶段发现miR-130b高水平表达，而抑制它的表达显著降低桑椹胚和囊胚的形成[65]，这些都表明miRNA对胚胎的生存能力起着重要调控作用。

子宫对着床的敏感度分为3个时期：预受期、接受期及不应期，而子宫只有在接受期才能接受和适应胚胎。在健康受孕女性的子宫内膜中，接受期与预受期相比，hsa-miR-30b和hsa-miR-30d上调，而hsa-miR-494下调，同时进一步分析发现这些miRNAs的靶基因参与了周期性的子宫内膜重建、子宫内膜成熟等过程[66]，说明miRNA对着床时期起着重要作用。在胚胎着床过程中，子宫液中的外泌体/多泡小体中的miRNA参与了母体与胚胎交流[59]。在人怀孕期间，母体循环系统中的滋养层细胞可能通过外泌体释放miRNAs（如miR-515-3p、miR-517a、miR-517c等），使胎盘组织中的miRNAs显著上升，而分娩之后又迅速降低[67]；在胚胎着床的不同时期，人的子宫液中由子宫内膜腺体分泌的miRNAs也发生改变，进一步研究发现母体子宫内膜的miRNAs可以作为着床前胚胎的转录组的调控子[68]。Cuman等[69]也表明，胚胎分泌的miRNAs可以参与子宫功能的调控。

4 小结与展望

表观调控是调节基因功能的一种重要手段，miRNA属于一种表观修饰。已有研究表明，miRNA广泛参与生物体内各种生理及病理过程，对哺乳动物繁殖起着至关重要的调控作用。但这个调节过程中还有很多问题值得进一步深入研究：第一，目前很多研究只是基于miRNA表达量而不是调节功能的研究，对于很多功能多是推测，至于具体是通过哪些关键基因、关键蛋白及通路的研究较少，机体内miRNA的调节机制尚不清楚。第二，在探究miRNA对由SSCs分化成精子过程的影响时，不同miRNA的具体作用方式及miRNA对相关的转录因子（如Bcl6B、SOX3、SYAT3等）是如何调控目前还不清楚。第三，因为存在一个miRNA可能多个靶mRNAs，而一个mRNA可能受多个miRNAs调控，在一些细胞的体外实验中注射miRNA模拟物或抑制剂探究某些特异预测的靶基因，可能引起表型的改变，但也不能排除其他靶基因的干扰，特别是将来miRNA可能作为疾病治疗的一种辅助药物时，是否对其他组织、细胞甚至DNA产生影响，值得进一步研究。第四，季节性发情是限制哺乳动物繁殖力的一个重要因素，下丘脑的中枢系统可以通过HPGA轴调节季节性发情，本文已经表明miRNA在下丘脑及HPGA轴相关组织中高度表达，且发现在常年发情和季节性发情品种中有很多差异的miRNA，因此可以推测miRNA对季节发情有影响，但目前还不清楚miRNA是怎样影响季节性发情。最新研究表明，miRNA可以通过转录后调控的方式调节生物钟基因的表达，而哺乳动物的生物钟系统和季节性繁殖周期系统则是随外界光照周期的变换相互联系，且有很多研究表明钟基因与季节性发情有关，因此推测miRNA可能通过生物钟系统及相关钟基因对哺乳动物的季节性繁殖活动进行调控，这还需要更多的实验进行验证。总之，这些问题的进一步研究将有利于理解miRNA对繁殖方面的表观调控，从而为改善哺乳动物繁殖能力提供理论基础。