褪黑素在卵巢中功能的研究进展

刘 颖，张艳敏，李文通 ，杨言昭，杨亚岚，葛长利，陈其美，周 荣，李 奎

（1.山东蓝思种业有限公司，山东日照276800；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193；3.佛山科学技术学院，广东佛山528231）

卵巢功能直接影响雌性动物的繁殖能力，进而对养殖业的经济效益产生影响。动物卵巢正常功能的维持受多种因素调节，包括促黄体素、促卵泡素、催乳素、褪黑素等[1-6]。褪黑素最早发现是一种由哺乳动物松果体分泌的神经内分泌胺类激素，之后发现在卵巢、胎盘等组织中也有褪黑素的分泌[7]。褪黑素通过其高亲和性膜受体参与调控动物生理节律、季节性繁殖和卵巢功能等生理过程。

研究发现外源性褪黑素对神经系统[8-9]、肾脏[10-11]、肺[12]、睾丸[13]、子宫[14-15]、卵巢[16]等均有保护功能。褪黑素可以通过与其功能性受体1（Melatonin Receptor 1，MT1）和 2（Melatonin Receptor 2，MT2）结合，发挥其调节牛睾丸支持细胞发育和功能的作用[17]。在发情期大鼠子宫内膜有125I标记的褪黑素（125IMelatonin，I-Mel ）特异性结合的受体以及MT1转录产物[18]。随后研究发现，来自子宫内膜癌患者的雌激素阳性细胞系有功能型受体MT2的存在[19]。人的子宫肌层有功能型受体MT1和MT2的分布，且在妊娠子宫和非妊娠子宫的表达和分布规律不同[20]。免疫组织化学、实时荧光定量PCR、蛋白质印记和共聚焦显微镜等技术和工具可揭示褪黑素受体在人胎盘组织以及绒毛膜癌细胞系JEG-3中的分布情况[21]。还有研究证明了滋养层细胞中褪黑素作用于受体MT1和MT2发挥抗凋亡作用[22]。另外，MT1和MT2以及褪黑素合成所需的酶的mRNA存在于前3个月的人类胚胎组织中[23]，MT1在大鼠胎盘中也有分布[24]。小鼠乳腺组织细胞膜和细胞核上存在I-Mel的特异性结合位点，这种特异性结合取决于生长规律、激素分泌规律和昼夜节律等因素[25]。本文就褪黑素的相关特性及在卵巢中的功能研究做一综述。

1 褪黑素受体在卵巢中的分布

在哺乳动物中，褪黑素受体（Melatonin Receptor，MTR）包括MT1和MT2[26-27]。用I-Mel测定发现在禽类、人、大鼠的睾丸、卵巢的间质细胞和排卵前的卵泡颗粒细胞中都有MTR[24]。Soares等[28]报道了MT1和MT2在大鼠卵巢中的表达。大鼠中褪黑素在卵巢中特异性结合的受体在发情前期比发情后期有所增加，表明雌激素能够调节MTR的表达[29]。Wang等[30]报道，MT1和MT2位于牛颗粒细胞的细胞膜、细胞质和核膜上，受褪黑素调节。El-Raey等[31]进一步揭示，MT1在牛卵丘卵母细胞复合体中表达，而MT2基因仅在卵母细胞中表达。在白牦牛卵巢中，MT1主要存在于原始卵泡、颗粒细胞、卵母细胞和黄体细胞，在黄体细胞中MT1的表达显著高于原始卵泡、颗粒细胞[32]。

此外，在卵泡液中发现高水平的褪黑素，并且在颗粒、黄体细胞和卵泡中存在褪黑素结合位点[30,33-34]。最近，MTR编码基因已在多种哺乳动物中进行研究[35]，在颗粒细胞、卵丘细胞和黄体细胞中均鉴定出MTR表达[22, 33]。

2 褪黑素在卵巢中的功能研究

2.1 褪黑素对卵巢类固醇激素合成的影响 研究表明，在卵巢中褪黑素通过与MTR结合调节类固醇生成。猪卵巢中，褪黑素能够抑制培养的颗粒细胞增殖和类固醇生成，特别是孕酮[36]。褪黑素可以抑制雌激素受体的表达和雌激素的活性[37]。褪黑素处理猪有腔卵泡（5～6 mm），会影响类固醇激素合成相关基因细胞色素P450家族成员11A1（Cytochrome P450，family 11，subfamily A，polypeptide 1，CYP11A1）、细胞色素P450羟化酶（Cytochrome P450，family 17，subfamily A, polypeptide 1，CYP17A1） 和 细 胞 色 素P45019A1（Cytochrome P450，family 19，subfamily A，polypeptide 1，CYP19A1）的表达及雄激素和孕酮的产生[38]。

松果体切除术或额外补充褪黑素都能够影响大鼠卵巢类固醇生成及其合成酶CYP17A1表达[39-40]。低剂量（100 μmol/L）褪黑素能够显著增加小鼠卵巢中雄激素和孕酮的产生，但对雌激素没有影响[41]。

褪黑素能够增加黄体数量以及孕激素受体的水平[42]。在体实验表明，褪黑素能够促进母羊孕激素的合成[43]。褪黑素与温度以剂量依赖性方式相互作用，在37.5 下增加孕酮，但在40.0 下降低孕酮。不管氧水平和温度如何，褪黑素都能减少活性氧（Reactive Oxy Gen Species，ROS）的产生，通过与温度以剂量依赖性的方式相互作用，影响颗粒细胞（Granular Cell，GC）的增殖和黄体化[44]。

2.2 褪黑素对卵泡和卵母细胞发育的调节作用 细胞培养和动物研究都揭示了褪黑素对体外和体内卵母细胞成熟、发育中的卵泡、胚胎发育和其他生殖活动的有益作用[45-48]。褪黑素可促进卵母细胞的成熟，并通过降低卵母细胞的氧化应激来提高人体后续受精率[49]。在猪中，外源性褪黑素也能促进体外卵母细胞的成熟[45]。褪黑素可以提高牛和山羊的卵母细胞质量[50-51]。

进一步的研究表明，褪黑素在颗粒细胞和卵母细胞中发挥重要作用。据报道，褪黑素可以在牛卵丘卵母细胞复合体中合成，并有利于牛卵母细胞的成熟[31]。最近的研究进一步证明了褪黑素在卵母细胞成熟、排卵及早期的胚胎发育中有着非常重要的功能[48]。研究表明，褪黑素能够降低人卵母细胞的氧化、促进卵母细胞成熟从而提高妊娠效率[49,52]。另外有研究证明，外源的褪黑素能够在体外促进猪卵母细胞的成熟[45,48]。Wang等[51]报道，褪黑素能够改善卵母细胞质量、促进胚胎健康发育[51]。在山羊体内埋植褪黑素能够促进卵母细胞发育[50]。褪黑素还能够在体外对猪卵母细胞的热应激起到保护作用[53]。

2.3 褪黑素对卵巢氧化应激的保护作用 已有研究表明，褪黑素在保护人类颗粒细胞和卵母细胞免受氧化应激有重要的功能[54-55]。此外，ROS能抑制人黄体细胞中黄体酮产生，而补充褪黑素能有效地预防与氧化应激有关的黄体期缺陷并增强妊娠早期黄体酮产生[56-57]。褪黑素可保护核和线粒体DNA免受自由基的伤害[58]。外源添加褪黑素以剂量依赖性方式保护小鼠细胞免受DNA损伤[59]。此外，褪黑素可减少大鼠电离辐射或毒性药物暴露导致的基因组损伤[60]。有趣的是，褪黑素还能够通过电子转移以高效率在人血细胞中修复DNA[61]。在氧化应激条件下，褪黑素的快速下降伴随着其代谢物水平的升高[62-63]。在小鼠体内，褪黑素通过减少细胞核、线粒体和质膜中的氧化应激来保护小鼠卵泡中颗粒细胞的完整性[64-65]。褪黑素作为抗氧化剂可能在局部起作用以降低牛卵巢中的氧化应激[66]。

2.4 褪黑素在卵巢中功能的总结 褪黑色在卵巢中的主要功能见表1。

表1 褪黑色在卵巢中的主要功能

3 褪黑素作用于卵巢的机理研究

尽管褪黑素在卵巢中的功能在不同物种中有许多报道，但褪黑素作用于卵母细胞和颗粒细胞的机制很少报道。褪黑素通过阻止PTEN/AKT/FOXO3a信号通路成员的磷酸化来减弱卵巢癌患者在化疗过程中对卵巢的损伤[67]。褪黑素在热应激下可下调颗粒细胞中肿瘤抑制蛋白p53的表达，上调B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和促黄体激素受体（Luteinizing Hormone Receptor，LHR）基因表达，这一研究为热应激过程中褪黑素对颗粒细胞保护作用的分子机制提供了证据[68]。在大鼠卵巢中褪黑素能够降低氧化应激标记丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的表达，相反，能够促进抗氧化标记过氧化氢酶（Catalase，CAT）及谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPX）的表达。此外，褪黑素可以通过上调大鼠卵巢中雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）和下游基因的表达对原始卵泡发挥保护功能[69]。大鼠卵巢中褪黑素能够显著上调腺苷酸环化酶9（Adenylate Cyclase9，ADCY9）基因的表达，同时环磷酸腺苷反应元件调节物（Cyclic AMP-responsive Element Modulator，CREM）和CYP17A1基因表达下调，进而影响卵巢类固醇激素的合成[40]。

综上所述，褪黑素受体在多个物种的卵巢中均有表达，褪黑素对卵母细胞成熟、类固醇激素合成等卵巢生理过程均有重要的调节作用。褪黑素有望成为提高卵母细胞质量、治疗不孕疾病的新的药物靶点，为进一步理解卵巢功能机制提供理论基础。