重组人源肺孢菌主要表面糖蛋白C共有抗原在肺孢菌肺炎诊断中的价值

王建成， 何之星

肺孢菌肺炎（Pneumocystispenumonia，PCP），是由耶氏肺孢菌（Pneumocystis jirovecii）引起的致死性呼吸系统机会性感染。即使引入高效抗反转录病毒治疗（HAART），PCP仍为HIV感染患者主要的并发疾病[1]，随着癌症患者、器官移植者等PCP高危人群的扩大，非HIV感染PCP患者日趋增多[2-3]。在世界范围内，PCP处于侵袭性真菌感染的第2位[4]，未经干预的PCP患者病死率接近100%。PCP临床症状、体征无特异性，致病机制尚不明确，缺乏无创、敏感的早期诊断方法。痰液和支气管肺泡灌洗液（BALF）标本病原体染色镜检为诊断PCP的“金标准”，但痰液标本检出率低，支气管肺泡灌洗属于有创操作，儿童患者或呼吸道功能衰竭患者难以耐受。近年来，无创、方便的侵袭性真菌感染检测血清学指标，如乳酸脱氢酶（LDH）、(1，3)-β-D 葡聚糖等被用于PCP辅助诊断，并取得一定效果[5-6]。主要表面糖蛋白（Msg）是肺孢菌胞壁主要成分，具有高度免疫原性及保护性B细胞和T细胞表位。Msg包括Msg A、Msg B和Msg C。Msg C 由MSG基因更为保守的C-末端编码，抗原性最强，目前多采用重组Msg C抗原进行PCP血清学研究[7]。MSG基因属于多拷贝基因，每次表达的Msg抗原不尽相同，且MSG基因拷贝间通过重组导致变异，这些机制导致耶氏肺孢菌 Msg抗原的多样性，以利于其逃避宿主免疫攻击[8]。不同地区的PCP患者血清对耶氏肺孢菌 Msg C亚型识别能力存在很大差异[9]。因此，合成能够与不同地区PCP患者血清抗体结合的共有抗原可能具有重要临床意义。本实验采用真核表达的Msg C共有抗原对PCP高危人群进行血清IgM检测，评价其临床意 义。

1 材料与方法

1.1 临床标本

血清标本来自2017年1－12月我院48例行支气管肺泡灌洗检查的非HIV感染PCP高危人群（高危组）和51例健康体检者（对照组）。高危组中男21例，女27例，平均年龄（56.5±15.9）岁；其中实体肿瘤化疗患者17例，白血病化疗患者15例，器官移植患者6例，自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、自身免疫性肝炎等）患者10例；对照组男23例，女28例，平均年龄（52.0±16.9）岁。

1.2 血清抗Msg C共有抗原IgM酶联免疫吸附测定（ELISA）方法

1.2.1 阴性标准血清制备 将复溶后的重组耶氏肺孢菌 Msg C 共有抗原（在美国杜克大学人类疫苗研究所完成设计、生产和纯化）按100 µg/cm2的量滴加在硝酸纤维（nitrocellulose，NC）膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h后用PBS洗膜，将重组抗原标记的NC膜放入20例随机血清中，作用1 h后弃NC膜，按上述方法重复1次，制备阴性标准血 清。

1.2.2 血清抗Msg C共有抗原 IgM ELISA检测 重组耶氏肺孢菌 Msg C 共有抗原按200 ng（浓度为2 mg/L）包被量包被96 孔板，2～8℃过夜，洗板2次，拍干后5%脱脂牛奶的PBS 封闭4 h后，拍干、过夜干燥后密封，2～8℃保存。将临床样本和阴性标准血清用PBS液按1∶10稀释，设空白对照，加样后2～8℃过夜， 每孔加入100 µL 1/750羊抗人IgG-HRP酶工作液，37℃，孵育60 min。充分洗板后加入A和B显色液各50 µL，37℃，孵育5 min，2 mol/L H2SO4终止后用酶标仪（450 nm/630 nm双波长）检测。每一块酶标板都带上20例阴性标准血清盘和4孔空白对照。用阴性标准血清盘的结果定义每块酶标板检测的cutoff值。样本D值=样本（D450～D630）- [空白（D450～D630）]，计算20 例阴性标准血清D值的95百分位数（Percentile 95，P95），如果阴性血清标本出现离群值后删除该值重新计算P95。样本D值大于阴性标准血清P95D值的2.1倍定义为阳性。

1.2.3 (1，3)-β-D葡聚糖检测 将-20℃冷冻保存的高危组和对照组血清学标本复融后，使用北京金山川科技发展公司的(1，3)-β-D 真菌检测试剂盒，严格按照说明书进行操作，反应结束后系统由标准曲线自动计算出待测血浆中葡聚糖含量，(1，3)-β-D葡聚糖值＞60 ng/L，即判定为阳 性。

1.2.4 呼吸道标本肺孢菌PCR检测 高危组48份支气管肺泡灌洗液标本按常规PCR方法扩增肺孢菌线粒体大亚基rRNA编码基因，具体步骤见文献 [10]。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学处理，正态分布采用K-S检验（Kolmogorov-Smirnov），非正态分布计量资料采用配对资料的Wilcoxon符号秩和检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗Msg C 共有抗原IgM 抗体ELISA检测结果

2.1.1 阴性标准血清制备 20例对照血清重组抗原吸附前后，抗Msg C共有抗原 IgM抗体检测D均为非正态分布，吸附前后D中位值分别为0.18和0.13，经配对资料的Wilcoxon符号秩和检验显示差异有显著统计学意义（P＜0.01）。

2.1.2 高危组和对照组两种血清学检测结果 99例标本中Msg C 共有抗原IgM抗体检测阳性率为28.3%（28例），(1，3)-β-D 葡聚糖检测阳性率25.3%（25例），两者差异无统计学意义；在高危组48例标本中两者阳性率差异亦无统计学意义（35.4%和33.3%）。见表1。两种检测方法总体一致性和高危组一致性分别为67.7%和52.1%。

表1 高危组和对照组Msg C共有抗原 IgM 抗体和(1，3)-β-D 葡聚糖检测结果Table 1 IgM antibody against Msg C consensus antigen and (1，3)-β-D glucan test in patients at high risk of Pneumocystis pneumonia and healthy control group[n ( % ) ]

2.1.3 高危组Msg C共有抗原 IgM 抗体检测与PCR检测结果比较 48例支气管肺泡灌洗液标本PCR检测15例阳性，阳性率为31.2%（15/48），与Msg C共有抗原 IgM抗体检测差异无统计学意义（P=0.665）；高危组Msg C共有抗原 IgM抗体检测与PCR一致性为58.3%。见表2。在两种血清学方法检验结果一致的25例标本中，与PCR结果一致性可提升到84.0%；若以任一种血清学阳性结果作为判读阳性标准，在高危组15例PCR阳性标本中的检出率达86.7%（13/15）。

表2 Msg C 共有抗原IgM 抗体检测与PCR检测结果比较Table 2 Results of IgM antibody against Msg C consensus antigen compared with PCR assay

3 讨论

重组Msg抗原在PCP的血清学诊断和疫苗研制领域均表现出潜在价值，已经通过动物实验初步证实了有效性[11]。野生 Msg抗原高度变异性导致各抗原亚型不能被彼此诱导的抗体识别，依据某一基因型制备的DNA疫苗/基因工程疫苗，其诱导的抗体不能对表达其他抗原亚型的菌株产生保护作用。共有DNA（consensus DNA）合成技术是将编码某一抗原的不同等位基因，通过生物技术软件进行编排（align）后，生成一条共有DNA链，克隆表达得到共有抗原，该抗原具有不同等位基因所编码抗原的免疫原共性，更易诱发适用于不同病毒亚型的广泛性中和抗体，该技术在HIV和流感免疫学诊治中发挥重要的作用[12-13]。我们在早期研究中证实了共有抗原比野生抗原具有更好的检测阳性率。

本研究采用Msg C共有抗原吸附20名健康人血清制备标准阴性血清，结果显示吸附后所制备的标准阴性血清IgM抗体D值显著降低（P＜0.01），保证了阴性血清的可靠性。此外，本课题采取2项改进措施以保证阴性血清D值的科学性。其一，考虑ELISA反应时间、温度以及不同操作人员可能都会对反应结果产生影响，在每一块酶标板检测内都带上了20例阴性标准血清盘，用阴性标准血清盘的结果定义每块酶标板检测的cutoff值，以此作为本板试验的临界值判定依据；其二，如果阴性血清标本出现离群值后删除该值重新计算P95。本研究PCP高危人群共有抗原IgM抗体阳性率（35.4%）低于文献所报道的合成抗原IgM抗体阳性率（68.0%）[14]，原因是研究对象、检验方法和阳性判定方式不同，如果采用受试者工作特征曲线（ROC）分析确定阳性cuttoff值，共有抗原在PCP高危人群IgM抗体阳性率可以提高到71.2%，该阳性率高于文献报道，原因是研究对象均为非HIV感染人群，非HIV感染患者Msg IgM抗体水平高于HIV感染患者[15-16]。

(1，3)-β-D 葡聚糖检测是目前用于深部真菌感染辅助诊断的常用方法[17-18]，(1，3)-β-D 葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，真菌被吞噬细胞吞噬处理后，其即可从胞壁中释放出来，导致血液及其他体液中含量升高。由于肺孢菌经18S核糖体鉴定为真菌，故(1，3)-β-D 葡聚糖亦被用于PCP的血清学诊断[19-20]。本实验PCP高危人群(1，3)-β-D 葡聚糖检测阳性率为33.3%，显著低于国外文献报道，主要原因是研究对象的差别，国外多入组已确诊的PCP患者[21]，本研究纳入的对象大部分为尚未明确诊断的高危人群。

本研究结果显示，Msg C共有抗原IgM检测和(1，3)-β-D 葡聚糖检测在高危组和对照组阳性率均无显著性差异，进一步分析显示两种检测方法的总体样本和高危组一致性分别为67.7%和52.1%，均处于较低水平。可能主要原因是两者检测靶物质不同，且受到的干扰因素亦不相同，如果增加样本数则阳性率差异可能会有统计学差 异。

下呼吸道标本PCR检测是呼吸道肺孢菌存在直接证据，本研究48例PCP高危人群中15例阳性，阳性率与两种血清学方法相近，分析显示PCR与两种血清学方法一致性均处于较低水平（58.3%和72.9%）。在两种血清学方法检验结果一致的25例标本中，与PCR结果一致性可提升到84.0%；若以任一种血清学阳性结果作为判读阳性标准，在高危组15例PCR阳性标本中只漏检2例，具有较好的阳性率。因此，在儿童、老年患者等BALF难以获得的群体中，联合应用Msg C共有抗原 IgM 抗体检测、(1，3)-β-D葡聚糖检测可一定程度上替代PCR方法。

进一步分析(1，3)-β-D 葡聚糖检测定量结果与PCR结果相关性发现，在14例(1，3)-β-D 葡聚糖检测＞180 ng/L的样本（阳性判定标准为60 ng/ L），有6例PCR阴性，其中＞600 ng/L的2份标本PCR和IgM 抗体均为阴性，与部分文献报道的PCP患者(1，3)-β-D 葡聚糖检测具有较好的灵敏度和特异度不相符[19]，原因可能包括：① (1，3)-β-D 葡聚糖特异性偏低，易受到真菌感染的干扰[22]，在研究制定入选标准时文献排除了真菌感染干扰，而本研究病例则未排除；② 高危组例数偏少，需要扩大样本量进一步分析，且所用试剂盒品牌和阳性判定标准均与其他研究不同。结合临床资料分析显示，6例IgM抗体和PCR均阳性患者中4例有PCP临床症状，并且从六亚甲基四胺银（GMS）染色标本中找到肺孢菌，其余9例PCR阳性，而IgM抗体阴性患者只有2例从GMS染色标本检出肺孢 菌。

综上所述，Msg C共有抗原IgM 抗体联合血清学指标(1，3)-β-D葡聚糖检测对PCP诊断具有一定的价值，两者均为阳性时应进一步进行下呼吸道标本PCR和传统细胞学染色检查。