2011－2016年上海市儿童医院临床分离细菌耐药性监测

王 春， 姚剑杰， 孙 燕， 秦惠宏， 潘 芬， 石迎迎， 张 泓， 葛青玮

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细菌 收集2011年1月—2016年12月上海市儿童医院临床分离的菌株，剔除同一患者分离的重复菌株及非无菌部位分离到的凝固酶阴性葡萄球菌。

1.1.2 培养基 参照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）[3]推荐采用需氧菌药敏培养基：MH琼脂培养基（上海伊华生物技术公司）；苛氧菌药敏琼脂培养基：5%脱纤维羊血MH琼脂、HTM琼脂（上海科玛嘉生物技术公司）。

1.1.3 抗菌药物纸片和E试验条 抗菌药物纸片均为英国OXOID公司产品；青霉素、万古霉素和替考拉宁E试验条为法国生物梅里埃公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌药敏试验 采用纸片扩散法行药敏试验，结果参照CLSI 2016年标准[3]判断，磷霉素的判断标准仅针对尿标本分离的粪肠球菌；替加环素的判断标准参照美国食品和药品监督管理局（FDA）文件标准。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922、大肠埃希菌产酶株ATCC 35218、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、铜绿假单胞菌ATCC 27853、粪肠球菌ATCC 29212、肺炎链球菌ATCC 49619、流感嗜血杆菌ATCC 49247。

1.2.2 β内酰胺酶检测[3]采用头孢硝噻吩试验定性检测流感嗜血杆菌的β内酰胺酶。按CLSI推荐的纸片法筛选和酶抑制增强确证试验检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌中的产超广谱β内酰胺酶（ESBL）菌株。

1.2.3 青霉素不敏感肺炎链球菌（PNSP）的检测 经苯唑西林纸片法测定抑菌圈直径≤19 mm的肺炎链球菌采用青霉素E试验条测定其最低抑菌浓度（MIC），脑膜炎分离株和非脑膜炎分离株分别按CLSI 2016年标准[3]判定为青霉素敏感、中介或耐药株（PSSP、PISP或PRSP）。

1.2.4 耐万古霉素肠球菌（VRE）检测 经万古霉素纸片法测定结果为非敏感株者用万古霉素和替考拉宁E试验条[3]复测确认。

2) 冷却着火储罐罐壁。针对着火储罐罐壁进行冷却，减少罐内油品热传导，一定程度上能避免沸溢。研究表明，有罐壁冷却比无罐壁冷却的油品燃烧线速度减小25%～30%，采用冷却措施后储罐发生沸溢时间有所延长，但储罐如已形成热层，罐壁冷却措施的作用将有限。

1.2.5 特殊耐药菌株定义 广泛耐药菌（XDR）指对除多黏菌素和替加环素外的其他抗菌药物全部耐药的菌株[4]。碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（CRE）定义[4]为对亚胺培南、美罗培南或厄他培南中任一种药物耐药者。

1.3 数据分析

采用WHONET 5.6软件对所有数据进行统计分 析。

2 结果

2.1 细菌及其分布

2011－2016年共分离到临床菌株23 259株，其中革兰阳性菌10 885株（46.8%），革兰阴性菌12 374株（53.2%）。6年中每年革兰阳性菌和革兰阴性菌的占比及主要细菌占比见表1 ，基本无明显差异。革兰阳性菌主要以链球菌属和金黄色葡萄球菌多见；革兰阴性菌主要以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和流感嗜血杆菌多见。

23 259株细菌中，住院和门诊患者各占84.0%和16.0%。标本分布情况显示：痰液等呼吸道标本占52.3%、血液13.6%、尿液12.7%、伤口脓液6.3%、粪便4.8%、无菌体液2.0%、阴道拭子1.0%和其他标本7.3%。呼吸道标本仍以肺炎链球菌（22.7%）为主，血液标本以凝固酶阴性葡萄球菌（71.6%）为主，尿液标本以大肠埃希菌（52.3%）为主。

2.2 革兰阳性球菌对抗菌药物的耐药性

2.2.1 链球菌属 2 916株肺炎链球菌中，脑膜炎株9株，非脑膜炎株2 907株。9株脑膜炎分离株中，1株对青霉素敏感，其余均为青霉素耐药株。2 907株非脑膜炎肺炎链球菌中PNSP的检出率为31.2%，PSSP的检出率为68.8%。药敏结果显示肺炎链球菌对红霉素、克林霉素耐药率最高（＞90%），对甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率较高（＞65%），未发现喹诺酮类、万古霉素、利奈唑胺耐药株，见表2。

表1 2011－2016年主要临床分离菌的分布Table 1 Distribution of bacterial species isolated from children between 2011 and 2016[n ( % ) ]

表2 2011－2016年非脑膜炎肺炎链球菌对抗菌药物的耐药率Table 2 Resistance of non-meningitis S. pneumoniae to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

β溶血链球菌中主要以化脓链球菌为主，对红霉素和克林霉素耐药率高（＞90%），未发现对青霉素、头孢曲松、万古霉素和利奈唑胺耐药菌株，见表3。无乳链球菌对青霉素、头孢曲松保持较高敏感率（＞90%），对红霉素、克林霉素耐药率为50%左右，未发现万古霉素、利奈唑胺耐药菌株。

2.2.2 葡萄球菌属 葡萄球菌属中，MRSA和MRCNS分别占各自菌种的35.8%和82.2%。MRSA和MRCNS对β内酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类和喹诺酮类的耐药率均显著高于MSSA和MSCNS。未发现对利奈唑胺、万古霉素和替考拉宁耐药的葡萄球菌。见表4、表5。

表3 2011－2016年化脓链球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 3 Susceptibility of Streptococcus pyogenes to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

表4 2011－2016年金黄色葡萄球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 4 Susceptibility of S. aureus to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

表4 （续）Table 4（continued）（%）

表5 2011－2016年凝固酶阴性葡萄球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 5 Susceptibility of coagulase negative Staphylococcus to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

2.2.3 肠球菌属 953株肠球菌属中，粪肠球菌428株（44.9%），屎肠球菌365株（38.3%），其他肠球菌160株（16.8%）。屎肠球菌对所测试的抗菌药物耐药率高于粪肠球菌。目前未发现对万古霉素、利奈唑胺和替考拉宁耐药菌株。见表6。

2.3 革兰阴性杆菌对抗菌药物的耐药性

2.3.1 肠杆菌科 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBL平均检出率分别是61.1%和75.1%。产ESBL菌株对所测试药物的耐药率均比非产ESBL株高。大肠埃希菌对碳青霉烯类最敏感，耐药率＜3%，其次为阿米卡星、哌拉西林-他唑巴坦和头孢哌酮-舒巴坦，6年总体耐药率分别为4.4%、4.8%、6.6%。各年大肠埃希菌对所测试抗菌药物耐药率和敏感率见表7。

表6 2011－2016年粪肠球菌和屎肠球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 6 Susceptibility of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016

表7 2011－2016年大肠埃希菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 7 Susceptibility of Escherichia coli strains to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

表7 （续）Table 7（continued）（%）

6年间肺炎克雷伯菌对所测试抗菌药物耐药率整体呈上升趋势，对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别由2011年的3.1%和4.8%上升至28.7%和37.4%，对阿米卡星、环丙沙星的耐药率分别从3.1%和5.8%上升至36.1%和47.5%，对哌拉西林-他唑巴坦和头孢哌酮-舒巴坦分别从20.6%和14.2%上升至50.4%和49.9%，对头孢菌素的耐药率也呈上升趋势，2016年耐药率＞65%，见表8。

表8 2011－2016年肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 8 Susceptibility of Klebsiella pneumoniae to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

6年共分离到272株鼠伤寒沙门菌和235株肠炎沙门菌，两者对氨苄西林耐药率较高（＞70%）。肠炎沙门菌对甲氧苄啶-磺胺甲唑、氯霉素的敏感率＞90%，鼠伤寒沙门菌对头孢曲松的敏感率最高（75.8%），其次是甲氧苄啶-磺胺甲唑（64.2%）。见表9。

2.3.2 不发酵糖革兰阴性杆菌 2011－2016年共分离739株铜绿假单胞菌和1 366株鲍曼不动杆菌。各年对抗菌药物耐药率见表10、表11。铜绿假单胞菌对所测试抗菌药物耐药率变化不大，对亚胺培南和美罗培南的耐药率均为15%左右。鲍曼不动杆菌对大多数抗菌药物的耐药率呈上升趋势，除了对头孢哌酮-舒巴坦的耐药率为26.7%，对其他所测试抗菌药物的耐药率大多＞50%，对碳青霉烯类（亚胺培南和美罗培南）耐药率较高，6年总体耐药率分别是62.7%和63.5%。

2.3.3 XDR革兰阴性杆菌 革兰阴性杆菌中，XDR细菌主要有鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌，其中鲍曼不动杆菌6年XDR占比呈逐年下降趋势（27.3%下降到20.0%）；而肺炎克雷伯菌呈上升趋势（0上升到14.9%），见表12。

2.3.4 流感嗜血杆菌 6年共分离流感嗜血杆菌1 747株，β内酰胺酶检出率40.7%。流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药率48.6%，对甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率最高为71.2%，对头孢噻肟、环丙沙星、阿奇霉素的不敏感率分别为14.4%、4.5%、17.6%，见表13。

表9 2011－2016年沙门菌属对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 9 Susceptibility of Salmonella spp. strains to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

表10 2011－2016年铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 10 Susceptibility of P. aeruginosa strains to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

表11 2011－2016年鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 11 Susceptibility of A. baumannii strains to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

3 讨论

统计2011－2016年我院细菌数据结构显示：革兰阳性菌和阴性菌所占比率均保持在50%左右，与同期2011－2015年CHINET细菌耐药性监测数据存在一定的差异[5-8]。6年间以链球菌属总体检出率最高（17.1%，3 982/23 259），主要以肺炎链球菌和化脓链球菌多见，这与综合性医院检出情况存在一定差异，且上述细菌主要分离自呼吸道标本，这可能与儿童人群上呼吸道感染主要以化脓链球菌多见，下呼吸道感染主要以肺炎链球菌多见这一现象存在一定的相关性。

表11 （续）Table 11（continued）（%）

表12 2011－2016年XDR革兰阴性菌分离情况Table 12 Prevalence of XDR gram-negative strains by year from 2011-2016

表13 2011－2016年流感嗜血杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 13 Susceptibility of H. in fl uenzae strains to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

6年中我院监测到的临床菌株主要来源于痰液等呼吸道标本（52.3%），其次为血液（13.6%）和尿液（12.7%）标本，与2011－2016年CHINET细菌耐药监测数据结构一致[5-9]。呼吸道标本仍是临床上最常见的样本，与我院呼吸科床位数比例较高（占全院病床数的10%）有一定关系。不同标本中分离到细菌的种类差异较大，痰液等呼吸道标本中以肺炎链球菌（22.7%）、金黄色葡萄球菌（19.2%）和流感嗜血杆菌（13.8%）为主；咽拭子以化脓链球菌（54.0%）和金黄色葡萄球菌（9.1%）为主，这一结果显示儿童呼吸系统感染主要以苛养菌为主，与成人明显不同[9]。血液标本以凝固酶阴性葡萄球菌（71.6%）、肺炎克雷伯菌（3.9%）和大肠埃希菌（3.8%）为主；尿液标本以大肠埃希菌（52.3%）、粪肠球菌（7.6%）和屎肠球菌（7.3%）为主；粪便标本中沙门菌的分离率在增加，志贺菌有所减少，可能与民众生活条件改善有关。

本次监测中金黄色葡萄球菌在革兰阳性菌中检出率最高，也是引起医院和社区呼吸道感染的主要病原菌。6年间MRSA主要分离自呼吸道标本，其次为伤口脓液，分离率由2011年27.4%上升至2016年42.9%，而2011－2016年CHINET细菌耐药监测数据显示成人MRSA检出率不断下降（从2011年60.1%持续下降到2016年的38.4%），这一现象需引起重视。6年来门诊患儿检出金黄色葡萄球菌228株，其中MRSA检出率为20.2%（46/228）；住院患者检出金黄色葡萄球菌2 903株，其中MRSA检出率37.0%（1 074/2 903），住院患者MRSA分离率高于门诊患者[9]。MRCNS略有下降，由2011年87.0%下降至2016年79.6%，主要分离自血液及无菌体液标本。MRSA和MRCNS对所测试抗菌药物的耐药率显著高于MSSA和MSCNS。MRSA对利福平和甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药率较低（＜15%），MRCNS对利福平的耐药率＜10%，对甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率显著高于MRSA，两者均未发现对万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁耐药株。

肺炎链球菌是检出率仅次于金黄色葡萄球菌的革兰阳性菌，可引起儿童细菌性肺炎、脑膜炎和急性中耳炎等相关感染性疾病。本次监测肺炎链球菌在呼吸道标本中检出率最高，非脑膜炎PNSP平均检出率为31.2%，对红霉素和克林霉素耐药率最高（＞90%），其次为甲氧苄啶-磺胺甲唑（＞65%），都较成人报道高，未检出万古霉素和利奈唑胺耐药株。肠球菌属中，屎肠球菌对绝大多数测试抗菌药物的耐药率显著高于粪肠球菌，未发现对万古霉素和利奈唑胺的耐药菌株。

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌是本次检出率排名前2位的革兰阴性菌。6年间肺炎克雷伯菌产ESBL的平均检出率高于大肠埃希菌产ESBL率。碳青霉烯类抗生素被认为是临床治疗革兰阴性杆菌感染的最后一道防线。随着一系列碳青霉烯酶的出现，临床分离的碳青霉烯类耐药菌日益增多，并且这些病原菌常同时携带其他多种耐药基因，几乎对所有抗菌药物耐药，该类菌引起的感染有很高的病死率。我院细菌耐药监测数据显示：大肠埃希菌对碳青霉烯类仍保持较高的敏感率（耐药率＜3%），但肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类的耐药率呈逐年上升趋势。本监测显示，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）对亚胺培南耐药率从2011年的3.1%上升至2016年的28.7%，与2005－2014年CHINET报道结果一致[10]，其升高原因考虑可能与患者的一般情况差、以往使用过抗菌药物、入住ICU、实质脏器或血液移植、外科手术、导管和引流管留置等因素有关[11]。据文献报道，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制主要是产碳青霉烯酶，其中成人CRKP主要以产KPC-2酶为主，儿童CRKP主要以金属酶NDM-1为主[12-13]。同时深入研究发现我院CRKP以金属酶NDM-1多见，主要在新生儿人群中播散流行[13]，针对此现象，需加强对重点病区的流行病学调查，采取积极有效的感控措施防止耐药菌在病区流行引起大范围扩散。

鲍曼不动杆菌是我院革兰阴性杆菌中耐药率最高的菌种，也是目前医院感染面临的最重要的问题。该菌对亚胺培南的耐药率从2011年的38.3%上升至2016年的68.4%，对其他受试抗菌药物的耐药率6年间呈锯齿形波动，提示可能存在该类菌株的克隆传播。需采取有效措施防止其进一步扩散。但儿童患者铜绿假单胞菌的耐药率变化不大，如对亚胺培南和美罗培南的耐药率6年间分别为4.7%～18.8%和4.7%～19.4%。

流感嗜血杆菌为儿童社区获得性肺炎的另一种重要病原菌。此次监测数据显示β内酰胺酶检出率在30%～60%，氨苄西林耐药率33.7%～54.6%，且已出现β内酰胺酶阴性氨苄西林耐药菌株（BLNAR）。文献报道流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药的主要机制是产β内酰胺酶水解β内酰胺类抗生素，常见的β内酰胺酶有TEM-Ⅰ和ROB-Ⅰ型2种，其中90%以上为TEM-Ⅰ型[14]，BLNAR的耐药机制是ftsI基因氨基酸位点突变引起青霉素结合蛋白PBP的结构改变使与氨苄西林等其他β内酰胺类抗生素的亲和力降低，不能被β内酰胺酶抑制剂所抑制[15]。通过进一步对我院流感嗜血杆菌耐药性和基因型分型的研究，表明我院呼吸道分离流感嗜血杆菌ftsI基因突变率高，以Ⅲ型为主，ftsI基因突变增加了流感嗜血杆菌对氨苄西林和头孢呋辛的耐药率[15]。

综上所述，6年监测数据表明患儿不同标本中细菌的分布各有特点，多重耐药菌株MRSA、CRKP、CRAB不断增长，特别是CRKP的显著增长不容忽视，需重视儿童耐药菌的监测，采取积极有效的防控措施，及时阻断耐药菌株的播散和流行，增强医护人员的卫生意识。