模式识别受体NOD2在髓样分化蛋白88缺陷小鼠抗分枝杆菌感染中的作用机制

梁锦屏 ， 陈少红 ， 张 倩 ， 汤业珍 ， 韩怀钦 ， 魏 军

结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染引起的慢性传染病。据世界卫生组织最新统计，全球有17亿人感染结核分枝杆菌，占全世界人口的23%[1]。我国作为全球30个结核病高负担国家之一，年发病人数约为130万，居全球第二位。宁夏作为全国及西部地区结核病高发重点省区之一，疫情长期处于传染病报告前列。加之近年来耐多药结核分枝杆菌的流行和广泛耐药结核分枝杆菌的出现，结核分枝杆菌/HIV共感染患者持续增加以及流动人口的增多等因素，给公共卫生带来严峻的挑战。

近年来随着天然免疫识别机制研究的突破性进展，对结核分枝杆菌的致病机制有了进一步的认识。机体多种细胞通过不同的模式识别受体识别结核分枝杆菌的结构成分，启动细胞内信号转导。其中Toll样受体（TLR）通路中髓样分化蛋白88（MyD88）依赖途径，通过激活MyD88及相应的下游效应因子活化 NF-κB，启动相应的基因转录，发挥抗炎作用[2-3]。但目前研究中对肺组织TLR与NOD2信号通路的关系，以及两条通路在结核分枝杆菌感染时，是否存在相互影响、共同调节的免疫机制仍不清。因此本研究以髓样分化蛋白88缺陷（MyD88-/-）小鼠（C57BL为遗传背景）感染分枝杆菌为切入点，探讨TLR通路中的MyD88依赖途径受阻时，肺组织中NOD2信号在抗分枝杆菌感染中发挥的作用，为进一步阐明NOD2信号与TLR信号通路在呼吸道相互作用机制，揭示结核分枝杆菌致病机制、寻求临床免疫治疗或设计新型疫苗提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 MyD88-/-小鼠购自南京大学模式动物研究所，野生型C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，6～8周龄，18～22 g，由宁夏医科大学医学实验动物中心在SPF条件下饲养繁殖，动物饲养及实验操作严格遵守实验动物的使用和管理原则。MyD88-/-小鼠均经PCR重复鉴定无误。

1.1.2 试剂 NOD2抗体（ABclonal公司，美国）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔 IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）、ECL化学发光液（Amersham，美国）、RNA提取试剂盒（天根生化科技公司）、全蛋白提取试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）、蛋白定量试剂盒（江苏凯基生物科技发展有限公司）、PVDF膜（Millipore，美国）、β-肌动蛋白（SANTA CRUZ）、小鼠白介素6（IL-6）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（深圳达科为生物技术股份有限公司）、RT-PCR试剂盒（TransGen Biotech），引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 动物实验分组及模型建立 将实验分为MyD88-/-和野生型C57BL/6两大组，每大组再各分为分枝杆菌减毒株（卡介苗，BCG）组和磷酸缓冲盐溶液（PBS）组，共4组，每组小鼠6只。每只小鼠腹腔注射4%水合氯醛进行麻醉，5 min后麻醉生效，采用非暴露式气管滴注方法，BCG组经气管滴注50 µL BCG菌液（1×106cfu/mL），PBS组经气管滴注50 µL无菌PBS。而后用细棉线挂住小鼠上齿，将其直立，垂直旋转，使液体在肺内均匀分布，建立小鼠肺部感染和对照模型，24 h后取材。

1.2.2 荧光定量PCR法检测 肺组织中NOD2基因表达 NOD2的引物序列：F 5'GCTTCGAGGGAACACATTCT 3'，R 5'CCCTACAGTCCACTCACAAAC 3'。反转录反应条件 ：42℃孵育 30 min，85℃加热 5 min反转录为cDNA。在荧光定量PCR仪上按照荧光定量PCR试剂盒说明进行PCR反应。

1.2.2 Western Blot法检测小鼠肺组织中NOD2的蛋白表达 按照全蛋白提取试剂盒说明提取小鼠肺组织中的全蛋白，并参考BCA 蛋白定量检测试剂盒对其进行定量。然后进行SDS-PAGE电泳，半干转至PVDF膜，浓度5%脱脂牛奶室温封闭1.5 h，加入特异性一抗于4℃过夜孵育，次日平衡到室温，PBST漂洗3次后，加入HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育2 h，PBST漂洗3次后用ECL底物显色，蛋白成像系统曝光检测。

1.2.3 ELISA法检测外周血中的IL-6含量 摘眼球取血，静置2 h，离心后收集血清，每管150 µL分装保存于-80℃，待测。按照小鼠IL-6 ELISA检测试剂盒说明检测，根据标准曲线，计算出IL-6的含 量。

1.2.4 统计学方法 应用SPSS 17.0软件进行统计学处理。实验数据以均数±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用t检验，多样本均数间比较采用One-Way ANOVA检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织中NOD2基因的表达

MyD88-/-和野生型小鼠经气管滴入BCG 24 h后，取肺组织提取RNA，利用荧光定量PCR技术检测两组NOD2基因的表达。MyD88-/-小鼠肺组织中NOD2表达显著高于野生型小鼠，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 MyD88-/-与野生型小鼠肺组织中NOD2基因表达Figure 1 The expression of NOD2 gene in lung tissues of MyD88-/- mice and wild type mice

2.2 肺组织中NOD2的蛋白表达

经Western Blot对各组小鼠肺组织中NOD2蛋白表达情况进行检测，结果显示，BCG感染组相比PBS对照组NOD2蛋白表达量显著升高；而MyD88-/-小鼠相比野生型小鼠NOD2蛋白表达量更高；两种小鼠中BCG感染组均比PBS对照组NOD2蛋白表达量更高。见图2。

图2 MyD88-/-与野生型小鼠不同处理后肺组织NOD2蛋白表达Figure 2 The expression of NOD2 protein in lung tissues of MyD88-/- mice and wild type mice

2.3 外周血IL-6的水平

气管滴注P B S后，M y D 8 8-/-小鼠I L-6[（69.37±30.63）pg/mL]与野生型小鼠IL-6[（56.21±26.42）pg/mL]水平差异无统计学意义。BCG感染后，MyD88-/-小鼠IL-6水平显著增高[（331.84±22.59）pg/mL]，与野生型小鼠[（297.79±49.34）pg/mL]间无显著差异，但均比同型小鼠的PBS对照组明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 ELISA法检测各组小鼠血清中IL-6含量Figure 3 Serum IL-6 level in MyD88-/- mice and wild type mice determined by ELISA

3 讨论

NOD2和TLR作为重要的固有免疫模式受体，是机体抵御病原微生物入侵的第一道屏障，既是固有免疫的始动因素，同时又是获得性免疫应答的调节因素。其中NOD样受体（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor，NLR）是胞内模式识别受体，最初认为NOD2识别脂多糖 （LPS）可不通过 TLR4受体直接激活 NF-κB 从而介导免疫炎性反应。现在发现NOD2能够识别的配体是广泛存在于革兰阴性菌、革兰阳性菌细胞壁中的胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）。NOD2由3个结构域组成，当C末端富含亮氨酸重复序列LRR探测识别配体后，会引起自身构象发生变化，暴露出位于受体分子中央的NOD结构域，触发寡聚体化与活化，继而暴露具有caspase活化募集的效应结构域（CARD）——丝氨酸/苏氨酸激酶RICK（又称RIP2或RIPK2），活化的受体作用蛋白2（receptor-interacting protein 2，RIP2）介导IKKγ泛素化，诱导NF-κB的转录。此外NOD2还能活化MAPK激酶通路中的p38与ERK。有研究发现NOD2-/-小鼠中肺泡巨噬细胞分泌抗炎因子减少，难以控制胞内结核分枝杆菌的增殖，表明NOD2有助于巨噬细胞控制结核分枝杆菌的慢性感染。研究显示，NOD2与TLR在机体抵抗病原体的反应中具有协同作用[4]。TLR耐受会增加机体重复感染的风险。有研究发现，在耐受的小鼠巨噬细胞中，NOD2基因的表达及活化明显增加；NOD2基因敲除后，小鼠对病原菌的易感性明显增加[5]。而本实验利用MyD88-/-小鼠建立BCG感染肺部模型，检测NOD2基因及蛋白的表达。结果提示，小鼠在MyD88依赖途径功能缺失时，NOD2信号可补充发挥免疫作用。这与Khan等[5]、Krishnaswamy等[6]、Compan等[7]的研究中如果缺乏TLR，细菌的识别依靠NOD1和 NOD2相一致。该结论体现了机体固有免疫系统中模式识别受体间的互作调控作用，即TLR信号介导的MyD88依赖途径受阻时，机体可利用另一种模式识别受体NOD2发挥抗感染免疫。

IL-6是一种重要的参与机体应激反应和免疫调节的细胞因子，参与肺部炎症的病理发展过程，在维持机体免疫防御与免疫自稳中发挥重要作用。本实验结果中BCG感染后，MyD88-/-小鼠与野生型小鼠IL-6水平较PBS组显著增高，但MyD88-/-小鼠与野生型小鼠IL-6的水平并无显著差异。机体感染分枝杆菌后，可通过激活其他通路，如TLR介导的MyD88非依赖途径、NLR、甘露糖受体、C型凝集素受体（C-type lectin receptor）及表面活性物质蛋白A受体（surfactant protein A receptors）等，以识别结核分枝杆菌的组成成分，启动细胞内信号转导通路，诱导特异性基因表达，分泌细胞因子和趋化因子发挥作用[8]。这也进一步暗示机体的免疫调控是复杂的网络体系，各信号通路之间往往存在相互作用与联系。本研究中MyD88-/-小鼠IL-6水平显著增高，是否有NOD2参与，课题组将后续利用NOD2-/-小鼠进行更深入的研究。