野黄芩苷对脑缺血再灌注损伤的作用及其机制

王震雨，张璐妮，邵 玉b，张玉影，陈加俊，刘晓阳*

(1.吉林大学中日联谊医院 a.神经内三科；b.超声科，吉林 长春130033；2.吉林大学公共卫生学院 卫生毒理学教研室)

野黄芩苷，又名灯盏花乙素，来源于高黄芩的叶，黄芩的茎、叶以及半枝莲全草等[1]。野黄芩苷可显著上调外源性血管生成因子，具备多层次、多靶点的治疗优势，在临床上作为常用药普遍应用于缺血性疾病[2,3]，但其机制尚不明确，因此，有必要研究野黄芩苷对脑缺血再灌注损伤的作用及机制。

1 材料

1.1 实验动物模型制备

仰卧位固定Wistar大鼠，从颈正中取纵切口长约2 cm，暴露游离左颈总动脉，穿线备用。分离并结扎同侧颈外动脉。结扎左颈总动脉近心端，将尼龙线头端自结扎处与分叉间取V形切口轻轻插入，进入大脑中动脉并阻断血流。固定尼龙线，记时，缝合，皮外尼龙线留1 cm。的，缺血1 h后将尼龙线抽出。这时对侧的脑血流会通过大脑动脉交通支来实现左侧脑组织的血流再灌注。

1.2 主要试剂

VEGF 抗体( 北京中杉公司)；即用型第二代免疫组化ElivisionTMplus试剂盒(Kit-9901)。

1.3 方法

1.3.1实验分组 Wistar雄性大鼠，48只(重270-300 g)，分成4组，缺血再灌注损伤组、缺血再灌注损伤+野黄芩苷低、中、高剂量组(剂量分别为12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg。适应性喂养1周后，6只/组用于病理形态学和免疫组化检查。

1.3.2HE染色 取蜡块制片后，切片脱蜡、水化，苏木素染色后1%盐酸乙醇分化，清水冲洗，1%伊红复染，常规行梯度乙醇脱水、二甲苯透明，最后树脂封片。

1.3.3免疫组织化学方法 切片常规脱蜡、水化，PBS冲洗3次，每次3-5 min。应用0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液修复抗原。冷却后加3%过氧化氢溶液50 μl，室温下孵育10 min阻断内源性过氧化物酶活性。PBS洗涤3次。除去PBS液后，滴加一抗(兔抗VEGF多克隆抗体)，4℃过夜。次日PBS冲洗3次，二抗孵育1 h，将切片进行显色，脱水、透明后树脂封片。24 h后选择每张切片3个不同视野，Image-ProPlus软件分析阳性产物吸光度值进行分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 缺血区细胞形态学变化

对照组镜下观察发现：海马组织的结构明显发生异常，细胞水肿明显，锥体细胞排列明显紊乱，无明显的层次结构。细胞间隙变宽，锥体细胞的数目减少。可见大量凋亡细胞。可见均质红染坏死物质和细胞核固缩、溶解等坏死特征。用药组海马组织细胞缺血性改变程度均轻于对照组，且随药物浓度增加，缺血性改变的减轻程度越明显。

2.2 缺血区细胞VEGF表达

免疫组化结果显示，低剂量组(12.5 mg/kg)、中剂量组(25 mg/kg)、高剂量组(50 mg/kg)各用药组的脑组织表达 VEGF蛋白表达是逐渐增高，与空白对照组比较，高剂量用药组差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同浓度野黄芩苷作用后脑缺血损伤组织VEGF蛋白表达变化

注:与空白对照组比较，1)P<0.05

3 讨论

目前研究关于单一中药活性成分的野黄芩苷的资料很少，其对保护脑缺血再灌注损伤的作用机制十分复杂。脑内病理性血管的生成可通过已分化的血管内皮细胞发生增殖、迁移而形成，其为脑缺血性疾病的重要特征之一。张静等人研究野黄芩苷及其衍生物的神经保护作用和脑靶向性时发现： 野黄芩苷及其衍生物均具有保护脑神经的作用，主要是野黄芩苷中的乙酯较其它成份可以明显通过血脑屏障，进而起到脑神经保护作用[4]。

而本实验则是利用野黄芩苷，研究其干预缺血部位脑组织的新血管生成的作用及机制。 缺血缺氧是血管生成的触发因素，脑内缺氧时可以刺激上游的缺氧诱导因子的水平上调，继而激活其下游的血管内皮细胞生长因子( VEGF)等一系列细胞因子的表达，激活血管内皮细胞进而启动新血管生成的过程[5]。另外，在脑缺血性疾病血管新生过程中， VEGF作为一种多功能细胞因子，具有促进微动脉和小动脉血管通透性增加，并使血管内皮细胞发生增殖、迁移及诱导血管生成等的作用[6,7]。

本实验利用结扎法造模后，应用不同浓度野黄芩苷给药，HE染色结果发现：用药组海马组织细胞缺血性改变程度均轻于对照组，且随药物浓度增加，缺血性改变的减轻程度越明显。这说明野黄芩苷具有减轻缺血脑组织损伤的作用，并且依赖药物剂量。而免疫组化结果显示，各用药组脑组织 VEGF蛋白的表达均明显增高，与空白对照组比较，高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。 这些实验结果进一步说明，野黄芩苷减轻脑缺血损伤的作用主要是促进了新血管的生成。但以上实验还需要进一步深入研究来阐明野黄芩苷抗脑缺血损伤的机制。