血清ANCA检测在系统性红斑狼疮疾病中的应用

董晓微,崔学强,张俊华,朴文花,2

(1.宁夏回族自治区人民医院 (西北民族大学教学合作医院) 临床医学检验诊断中心,宁夏 银川750002;2.西北民族大学第一临床学院,宁夏 银川750002)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)临床症状较为复杂，通常以多系统侵害为主要表现，尤其是肾脏、皮肤血管炎损伤较为严重，其发病原因较为复杂。近几年，全世界对SLE患者的检测方法较为重视，抗中性粒细胞胞浆抗体(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)的发现为SLE的检测有推动性影响。ANCA是一种免疫球蛋白，在系统性血管炎患者中具有较高的阳性检出率，如类风湿关节炎、溃疡性结肠炎等，在自身免疫性疾病中较为多见。有研究称，SLE患者ANCA检测阳性检出率较高，且能够监测SLE疾病活动性[1,2]。既往临床上以间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence，IIF)作为检测ANCA的“金标准”，具有简便、廉价等优势[3]。但IIF具有一定局限性，例如无法做定量分析，而酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)能够弥补IIF的不足，考虑可能适用于SLE患者ANCA的检测，本文对此展开研究，报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料选择62例2015年9月-2017年9月在医院接受治疗的SLE患者，所有入选者均有完整的IIF检测ANCA资料，并对阳性ANCA患者进行ELISA检测，患者年龄43-75岁(均62.17±3.08)岁，男8例，女54例；另选择同期经ELISA检测ANCA的正常人群51例，年龄29-78岁(均58.74±4.15)岁，男8例，女43例，两种群体人口学资料差异不显著(P>0.05)。纳入标准[4]：(1)均达到美国风湿病学会于1997年修订的SLE诊断标准[5]；(2)患方对检测项目知情，签订知情同意书；(3)患者均为成年人；(4)患者在检测过程中依从性良好。排除标准：(1)有严重代谢类疾病、重大脏器受损者；(2)合并精神障碍者；(3)资料不全者。

1.2方法抽取入选者4 ml静脉血，放置于无菌的真空生化试管内，由专人以3 000 r/min离心10 min，获得全部入选者的血清样本。ANCA检测首先以IIF进行，用PBS缓冲液稀释患者血清，浓度比为10∶1，依据试剂盒上的操作说明，规范操作，分出阴性、阳性、空白对照结果。再将IIF检测结果为ANCA阳性的入选者进行ELISA蛋白水解酶3(Proteolytic enzyme 3，PR3)、抗髓过氧化物酶(Myeloperoxidase resistance，MPO)检测，并通过PR3、MPO含量判断ANCA阳性情况。

1.3评价指标比较健康入选者、其他疾病患者和SLE患者阳性ANCA检出率的不同，并统计ANCA阳性患者和阴性患者SLE活动指数(systemic lupus erythematosus diseaseactivity index，SLEDAI)方面的差异。本研究SLEDAI观察指标包括贫血、补体、肾功能、dsDNA抗体、皮肤血管炎、发热、肺间质变、关节肿痛、血沉。对SLE患者活动指标情况进行判读，SLEDAI积分低于10分为非活动性，超过10分为活动性[6]。

2 结果

2.1SLE患者、健康人群ANCA阳性检出率的比较SLE患者和健康人群ANCA阳性检出率有显著差异(P<0.05)，见表1。

2.2SLE患者ANCA检测和SLE活动性指标的关系SLE患者补体C3或C4下降、肺间质变、皮肤血管炎、肾功能受损、dsDNA抗体阳性方面ANCA阳性显著高于ANCA阴性(P<0.05)，而贫血、血沉>20 mm/h、发热、关节肿痛ANCA阳性和ANCA阴性间差异不显著(P>0.05)，见表2。

表1 SLE患者、健康人群阳性ANCA检出率的比较

表2 SLE患者ANCA检测与SLE活动性指标的关系

2.3SLE患者ANCA阳性与SLEDAI的比较对ANCA阳性SLE患者进行SLEDAI积分评价，≥10的占比为73.91%，ANCA阴性SLEDAI积分≥10占比为58.97%，有显著差异(P<0.05)，差异显著(P<0.05)，见表3。

表3 SLE患者ANCA阳性与SLEDAI的比较

3 讨论

SLE为一类典型的自身免疫性疾病，其病理学机制可能是受到可溶性抗原—抗体免疫复合物在血管壁上积聚，或者是自身抗体受到免疫介导，高度活化了机体内的B淋巴细胞、T淋巴细胞等，形成免疫复合物，使病变延伸到机体多个脏器或组织，诱发多系统的免疫学异常，形成大量具有高亲和力的自身抗体，针对健康细胞不同成分进行抑制，诱发本病[7-9]。如果本病患者得不到及时、有效的诊断和治疗，病情会长时间恶化，预后较差。

ANCA主要存在于单核细胞胞浆或中性粒细胞内，是一种与胞浆中溶酶体酶发生反应的抗原抗体，于1990年在系统性血管炎中被发现，而随着临床研究进展，ANCA逐渐被发现于SLE患者血清中，作为血清学标记性抗体之一，但关于ANCA与SLE的具体诊断意义却一直缺乏系统评价[10]。同时，临床上诊断ANCA的方法也多种多样，比如免疫沉淀法、IIF、ELISA、放射免疫法等，其中以IIF检测ANCA的临床应用时间较长，是一种较为经典的ANCA检测方法，同时也作为ANCA检测的“金标准”，但其单独使用的缺点是由于受到乙醇固定过程中有核糖体P蛋白、线粒体等物质，易造成自身抗体和其结合，形成强弱不等的荧光，对ANCA结果造成影响[11-13]。IIF尽管能测定总ANCA情况，但难以区分靶抗原，需要添加特异性检测。ELISA因为具有能够定量测量PR3、MPO。PR3、MPO均为ANCA的主要抗原。PR3是一类丝氨酸蛋白酶，存在于中性粒细胞胞浆嗜天青颗粒内，具有促进血小板活化，降解外基质如弹性蛋白、IV型胶原的能力，是诊断血管炎的重要指标之一。MPO是一类血红素蛋白酶，主要存在于髓系细胞嗜苯胺蓝颗粒之中，属血红素过氧化物酶的一种，为髓细胞特异性标志[14]。二者与SLE疾病活动度有显著相关性，因此ELISA在ANCA的测量中具有良好效果。但出于最优化选择、成本方面的计划，先进行IIF，再进行ELISA为目前为止ANCA检测的最佳方式[15]。

本研究通过分析ELISA结合IIF对健康人群和SLE患者ANCA阳性检出率的比较，发现SLE患者阳性检出率明显高于健康人群，提示ANCA具有可能诊断SLE疾病的意义，但关于ANCA对SLE的影响机制尚不明确。通过观察ANCA阴性、ANCA阳性患者临床症状和实验室指标等活动性指标方面的差异，发现ANCA阴性和ANCA阳性患者在血沉>20 mm/h、贫血、关节肿痛、发热方面没有显著差异，而在肾功能受损、皮肤血管炎、肺间质变、补体C3或C4下降、dsDNA抗体阳性方面差异显著，ANCA阳性患者SLEDAI≥10的占比明显高于ANCA阳性患者，提示SLEDAI、活动性指标和ANCA阳性检出情况之间有一定关系。这考虑是ANCA阳性在SLE患者狼疮病情活动期会产生毛细血管扩张、血管病变加剧等特点，形成皮肤血管炎，或者部分患者伴有肺间质变、肾小球肾炎等病情，累及患者肺、肾等器官组织，加重病情。ANCA阳性在dsDNA抗体阳性方面有显著差异，考虑是dsDNA抗体是一种具有双链DNA结构的抗体，能够和DNA结合，形成免疫复合物，沉积于肾小球基底膜，是SLE活动期的重要指标[16]。C3、C4均为补体系统中较为重要的组成部分，具有激活主要途径的生物学功能，补体C3或C4下降能够说明SLE病情的发生及发展，在本研究中，补体C3或C4下降提示SLE处于活动期。而ANCA阳性对贫血、关节肿痛、血沉>20 mm/h、发热等症状没有显著影响，考虑ANCA阳性在这些方面敏感性不高，或者受到样本数量限制的影响，产生一定偏差。总之，ELISA检测所得的ANCA阳性率可能从一定程度上可以反映SLE病情的严重程度、疾病活动度。

综上所述，对于SLE患者，在常规IIF检测ANCA的基础上，增加ELISA检测，所测得的ANCA阳性准确率较高，ANCA阳性能够从一定程度上反映SLEDAI、SLE疾病活动性，ANCA阳性与SLE疾病诊断之间有一定关联。