TNF-α、FoxM1在结直肠癌组织中的表达及相关性分析

眭文妍 范晓慧 陈丽红 赵文丽 彭晓峰

【摘要】 目的：研究在结直肠癌（CRC）组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与叉头框转录因子M1（FoxM1）的表达情况并分析其相关性。方法：选取2017年10月-2018年10月本院收治的CRC患者60例。所有患者均经手术治疗，术后均留取病灶标本（CRC组织），并取远离癌组织中心5 cm以上的组织为对照标本（癌旁组织）。以Western blot法检测CRC组织与癌旁组织TNF-α与FoxM1中的表达情况，并分析TNF-α与FoxM1在CRC组织中的相关性。结果：CRC组织TNF-α、FoxM1蛋白相对表达量均高于癌旁组织（P<0.05）;组织分化程度Ⅲ、Ⅳ级和Dukes C、D期，以及有淋巴结转移、侵及浆膜层及以外的CRC组织TNF-α与FoxM1蛋白相对表达量均分别高于组织分化程度Ⅰ、Ⅱ级和Dukes A、B期，以及无淋巴结转移及未侵及浆膜层的CRC组织（P<0.05）;TNF-α与FoxM1呈正相关（r=0.587，P<0.05）。结论：TNF-α、FoxM1的高表达与CRC的发生、发展有关，且两者有明显的正相关，可为CRC的诊断及预后判断提供指导，并能作为新的治疗研究靶点。

【关键词】 结直肠癌; 肿瘤坏死因子-α; 叉头框转录因子M1; 相关性

Expression and Correlation Analysis of TNF-α and FoxM1 in Colorectal Cancer Tissues/SUI Wenyan，FAN Xiaohui，CHEN Lihong，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（26）：119-122

【Abstract】 Objective：To study the expression of TNF-α and FoxM1 in colorectal cancer（CRC）and to analyze their correlation.Method：60 patients with CRC admitted to our hospital from October 2017 to October 2018 were selected.All patients were treated with surgery，and all lesions were collected postoperatively（CRC tissue），and tissues more than 5 cm away from the center of cancer tissue were taken as control specimens（adjacent tissue）.The expression of TNF-α and FoxM1 in CRC tissues and adjacent tissues were detected by Western blot，and the correlation between TNF-α and FoxM1 in CRC tissues was analyzed.Result：The relative expression of TNF-α and FoxM1 protein in CRC tissues were higher than those in adjacent tissues（P<0.05）.The relative expression of TNF-α and FoxM1 protein in CRC tissues with differentiation degree Ⅲ，Ⅳ level，Dukes C，D period，lymph node metastasis，invasion into serous layer and beyond were higher than those in CRC tissues with differentiation degree Ⅰ，Ⅱ level，Dukes A，B period，no lymph node metastasis and no serous layer invasion，respectively（P<0.05）.TNF-α was positively correlated with FoxM1（r=0.587，P<0.05）.Conclusion：The high expression of TNF-α and FoxM1 is related to the occurrence and development of CRC，and they are positively correlated.They can provide guidance for the diagnosis and prognosis of CRC，and can be used as new therapeutic research targets.

【Key words】 Colorectal cancer; Tumor necrosis factor-α; Fork frame transcription factor M1; Correlation

First-authors address：Huizhou First Peoples Hospital，Huizhou 516003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.26.032

結直肠癌（CRC）是临床常见的消化道肿瘤，也是全球三大最常见的癌症之一，其死亡率居于恶性肿瘤死亡的第4位，近年来我国的结直肠癌发病率呈逐年升高，已经成为威胁我国居民健康的常见肿瘤[1]。目前手术辅助放化疗是CRC的主要治疗方式，但患者的5年生存率仍较低，随着临床对肿瘤标志物研究的深入，通过寻找CRC的特异性标志物进行精确的靶向治疗成为临床的重要研究内容[2]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）由脂肪组织中的单核-巨噬细胞系统分泌，也是发现最早的能使肿瘤组织发生出血性坏死的细胞因子，已经成为肿瘤靶向治疗的新靶点之一[3]。叉头框转录因子M1（FoxM1）是一种与增殖相关的转录因子，是预测CRC患者无瘤生存期及总生存期的重要指标[4]。本研究主要对CRC组织中TNF-α、FoxM1的表达及相关性进行分析，为CRC的靶向治疗策略提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年10月-2018年10月本院收治的60例CRC患者，纳入标准：均为原发性结直肠癌，且经结肠镜活检、临床病理切片证实，符合《中国结直肠癌诊疗规范（2015版）》中对结直肠癌的诊断标准[5]。排除标准：伴有心、肝、肾等重要器官功能异常、伴有急慢性感染性疾病者;在病理检查及手术治疗前接受过相关放疗、化疗及其他辅助治疗者。60例CRC患者中男34例，女26例;年龄42～85岁，平均（65.2±7.5）岁;组织分化程度：Ⅰ级10例、Ⅱ级26例、Ⅲ级20例、Ⅳ级4例;Dukes分期：A期12例、B期25例、C期15例、D期8例;淋巴结转移38例、未转移22例;浸润浆膜层及以外35例、未侵及至浆膜层25例。所有患者入院后均经手术治疗，术后均留取病灶标本（CRC组织），并取远离癌组织中心5 cm以上的组织为对照标本（癌旁组织）。所有患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法 试剂：兔抗人FoxM1多克隆抗体为圣克鲁斯生物技术（上海）有限公司（SANTA CRUZ Biotechnology Inc）产品，EN Vision免疫组化检测试剂盒[由赛默飞世尔（中国）科技有限公司]。方法：CRC组织与癌旁组织TNF-α、FoxM1蛋白表达检测：以10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm厚度连续切片。Western blot检测TNF-α、FoxM1蛋白表达情况，取适量组织加入裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）匀质裂解后反复离心，取上层清液提取蛋白，以BCA蛋白定量法进行蛋白浓度检测，100 ℃水浴锅中煮沸5 min使蛋白质变性，配置10%聚丙烯酰胺凝胶（SDA-PAG），每孔中加入蛋白与加样缓冲混合液适量，垂直电泳分离，将含TNF-α、FoxM1与内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的胶段切下移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，以5%脱脂奶粉密封6 min后分别加入20 mL FoxM1（1︰300）与GAPDH（1︰3 000）一抗稀释液，于4 ℃环境下过夜，次日洗膜完全后加入二抗稀释液（1︰3 000）室温下孵育1 h，洗膜完全后以ECL发光液进行显影，以Image J进行灰度值分析，目的蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值的比值记为相对表达量。

1.3 观察指标 （1）对比CRC组织与癌旁组织的TNF-α、FoxM1蛋白相对表达量。（2）比较不同病理参数的TNF-α、FoxM1蛋白表达情况。主要比较不同组织分化程度、临床分期、淋巴结转移、浸润程度患者的TNF-α及FoxM1蛋白表达情况。（3）分析TNF-α与FoxM1在CRC组织中的相关性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 23.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，使用Pearson相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNF-α及FoxM1表达情况比较 CRC组织中TNF-α与FoxM1蛋白的蛋白相对表达量均高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 不同病理参数的CRC组织中TNF-α、FoxM1蛋白表达情况比较 组织分化程度Ⅲ、Ⅳ级TNF-α蛋白与FoxM1蛋白相对表达量高于Ⅰ、Ⅱ级，差异均有统计学意义（P<0.05），Dukes分期C、D期TNF-α蛋白与FoxM1蛋白相对表达量高于A、B期（P<0.05），有淋巴结转移的TNF-α蛋白与FoxM1蛋白相对表达量高于未转移（P<0.05），侵及浆膜层及以外的TNF-α蛋白与FoxM1蛋白相对表达量高于未侵及浆膜层，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 相关性分析 经Pearson相关性分析，在CRC组织中TNF-α与FoxM1蛋白表达呈正相关（r=0.587，P=0.010）。

3 讨论

随着社会的发展进步，人们的生活水平逐渐提高，各种高糖、高脂肪及高热量食物的摄入量增多，另外受吸烟、肥胖及缺乏锻炼等因素影响，结直肠癌的发病率逐渐增加[6]。结直肠癌早期的症状并不明显，多数患者就诊时已进入晚期，其病情进展快，预后差，病死率高，因此如何提高对结直肠癌的诊断、治疗效果具有重要意义[7-8]。已知结直肠癌发生涉及众多因子的相互作用，并与基因突变有一定的关系，因此分析靶向治疗成为本病治疗的新途径，探讨结直肠癌的新型肿瘤标志物和治疗靶点成为结直肠癌治疗的研究热点[9-10]。

本研究结果显示CRC组织中的TNF-α及FoxM1蛋白相对表达量均高于癌旁组织（P<0.05），说明TNF-α与FoxM1蛋白的高表达与CRC的发生有关;组织分化程度Ⅲ、Ⅳ级和Dukes C、D期，以及有淋巴结转移、侵及浆膜层及以外的CRC组织TNF-α与FoxM1蛋白相对表达量分别高于组织分化程度Ⅰ、Ⅱ级和Dukes分期A、B期，以及无淋巴结转移、未侵及浆膜层的CRC组织（P<0.05），且经Pearson相关性分析TNF-α与FoxM1蛋白相对表达呈正相关（P<0.05），说明TNF-α与FoxM1的蛋白表达水平与临床病理特征有关，参与CRC的病理发展过程，两者可相互影响。有研究表明，肿瘤的微环境由肿瘤细胞、间质细胞（炎性细胞、成纤维细胞）、趋化因子等共同参与，而炎症细胞是其重要组部分，因此在结肠癌的发展、发展过程中起到促进作用[11-12]。TNF-α作为与肿瘤相关的细胞巨噬细胞分泌的因子，可启动机体的慢性炎症，通过激活和转录因子κB和活化蛋白1两种炎性信号通路关键因子，促进细胞的增殖和逃逸，从而促进肿瘤细胞的定植[13-14]，還能稳定肿瘤上皮间质转化的相关转录因子Snail，促进肿瘤的转移[15-17]。有研究显示内源性分泌的TNF-α可诱导成纤维细胞分泌蛋白酶，破坏间皮表层，促进肿瘤细胞的浸润，破坏间皮表层导致肿瘤发生浸润，并能通过调控中性粒细胞的基因表达，促进肿瘤的转移和生长。FoxM1是叉头盒蛋白家族的重要成员，在结肠、小肠、睾丸、胸腺等成人组织分裂活跃的细胞中均有表达，在静止期活分化的细胞中几乎不表达，能通过激活尿激酶型纤溶酶原激活剂受体促进结直肠癌细胞的侵袭、分化、转移及浸润[18-19]。因此相较于组织分化程度Ⅰ、Ⅱ级和Dukes A、B期，以及未发生淋巴结转移及未侵及浆膜层的CRC组织中，组织分化程度Ⅲ、Ⅳ级和Dukes C、D期，以及发生淋巴结转移、侵及浆膜层及以外的CRC组织中的TNF-α与FoxM1蛋白相对表达量更高。而TNF-α蛋白表达的异常升高，可促进肿瘤细胞的转移、浸润、定植，从而使FoxM1的表达量增加，因此两者有正相关的关系[20]。

综上所述，TNF-α与FoxM1均参与肿瘤的发生与发展，且两者呈正相关，可成为CRC的诊断、预后监测因子及新型的治疗靶点。

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（收稿日期：2019-02-18） （本文编辑：田婧）