调脉饮及其拆方对快速性心律失常大鼠模型心肌L型钙通道β2亚基表达的影响

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快速性心律失常通常是因心搏频率远远高于正常范畴，或是由于冲动传导途径发生异常而导致病人产生的一种心律失常，可影响血液循环，对病人生命安全构成极大威胁。随着我国冠心病、高血压、糖尿病等发病率的增高，人口老龄化程度不断增加，心律失常发生率也随之增高，严重危害到病人的生命安全[1-2]。

虽然近年来射频消融术埋藏式心律转复除颤器(ICD)、外科手术等治疗心律失常的方法取得进展，但由于其治疗范围有限，具有一定侵袭性，并且费用昂贵，难以广泛开展，因此抗心律失常药物仍占主要地位[3]。当前，抗心律失常药物主要是通过调节心肌细胞膜的离子通道抑制心律失常的发生[4]。临床试验表明，多种抗心律失常药物可引发致死性心律失常[5]。因此，亟需药效好、副作用少的药物以及新的治疗策略来控制心律失常。有研究发现，中药可以通过调节基因表达量来维持细胞内环境稳态，从而改善心肌细胞整体功能[6]。中药治疗心律失常与基因调节有着非常紧密的关系，并有望成为心律失常研究的新热点。

调脉饮是国家级名老中医魏执真教授潜心研究多年治疗快速性心律失常的有效方剂，经30年的临床实践证实，调脉饮对快速性心律失常疗效显著，与心律平(普罗帕酮)疗效相当[7]。调脉饮全方由丹皮、赤芍、黄连、太子参、麦冬、五味子香附、香橼、川芎、丹参等中药组成，以益气养心、理气通脉、凉血清热为法。在调脉饮的拆方实验研究中发现[8]，调脉饮全方及凉血清热药组均具有抗乌头碱致实验性快速心律失常作用，凉血清热组较行气通脉、益气养心组对乌头碱及哇巴因致心律失常的抑制作用明显，且可降低心律失常的持续时间，为从“瘀热”论治快速型心律失常提供了应用基础。本研究观察调脉饮及拆方对快速性心律失常大鼠模型心肌L型钙通道β2亚基(LTCC β2)表达的影响，进一步探讨调脉饮的抗心律失常作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 Wistar大鼠60只，雌雄各半，SPF级，体质量(280±20) g。由军事医学科学院提供[批号SCXK-(军)2012-0004]。

1.2 受试药物 中药颗粒由北京中医药大学东直门医院药剂科提供。实验给药浓度及给药量参照前期研究资料[8]，根据临床等效剂量换算(生药量g/kg)：全方组大鼠给药剂量22 g/kg；凉血清热组大鼠给药剂量7 g/kg；行气通脉组和益气养心组大鼠给药剂量7.5 g/kg。

1.3 主要试剂与药品 乌头碱：成都普瑞法科技开发有限公司，批号PRF7033041；戊巴比妥钠：Sigma公司，批号1010N0310；可达龙(盐酸胺碘酮片)：赛诺菲(杭州)制药有限公司，批号2A13819；GoScript Reverse Transcription System、GoTaq®qPCR Master Mix(美国Promega公司，货号：0000076581)；β-actin、LTCC β2mRNA引物设计使用Primer5.0软件设计，中美泰和生物技术(北京)有限公司合成，引物序列如下：β-actin 上游引物5′-AGGCCCCTCTGAACCCTAAG-3′，下游引物5′-TGCCACAGGATTCCATACCC-3′；LTCCβ2：上游引物：5′-AAGCAAGCACCTCAATGTCCAG-3′，下游引物：5′-TAGTCGGCGAGATGCTCACAG -3′；β-actin、LTCC β2抗体(英国Abcam公司，货号ab93606)

1.4 仪器 多道自动分析心电图机(北京福田电子医疗仪器有限公司，FX-7202)；美国ABI 7500 Real-Time PCR仪；美国BINTA数码凝胶成像系统；美国Image-Pro Plus Analysis Soft ware计算机图像分析仪。

1.5 动物分组 将大鼠按照雌雄随机数字表法分为6组：模型组、调脉饮全方组(全方组)、凉血清热主要功效组(凉血组)、益气养心辅药功效组(益气组)、行气通脉辅药功效组(行气组)、胺碘酮组(西药组)，每组10只。按上述受试药物给药剂量给予相应药物，胺碘酮组给予胺碘酮100 mg/kg；模型组给予等量生理盐水，灌胃给药7 d，末次给药30 min 后进行实验。

1.6 造模记录心电图 将小鼠用0.4% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后仰卧位固定于鼠台上，连接心电图导联电极，常规记录Ⅱ导联心电图(ECG)。5 s内快速由舌下静脉按0.2 mL/100 g体重注入乌头碱溶液，乌头碱溶液的配制方法：精确称取乌头碱2 mg，先加入少量稀盐酸，然后加蒸馏水至100 mL，调节pH至7.0，配成浓度为20 μg/mL。监测心电图，待出现心律失常后，连续记录心电图变化，并同时用秒表分别记录室性早搏(VPB)、室性心动过速(VT) 和室颤(VF) 出现的时间及死亡(CA) 时间。心律失常消失恢复窦性心律300 s以上或出现死亡后停止记录。

1.7 钙离子通道基因和蛋白表达

1.7.1 标本采集 各组记录完最后心电图后，立即开胸，充分暴露出心脏，分离心脏与周围组织，取出心脏，迅速根据心尖搏动的位置剪取(200～300) mg左心室心肌，用冷0.9%氯化钠溶液冲洗血液，放入用焦炭酸二乙酯(DEPC)水处理过的冻存管中，用液氮速冻，以-70 ℃低温冰箱保存，待做逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)。

1.7.2 RT-PCR检测 取液氮冻存的大鼠心肌组织，采用Trizol法提取组织总RNA，利用GoScript Reverse Transcription System试剂盒进行反转录，退火25 ℃ 5 min，延伸42 ℃ 1 h，灭活70 ℃ 15 min，得到cDNA；20 μL反应体系，2 μL cDNA稀释液加入10 μL GoTaq反应液、7.2 μL Nuclease-Free Water和0.8 μL引物混合物，置于Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System进行反应，反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40次循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s溶解。运用2-△△CT相对定量法比较各组目标mRNA表达差异。

1.7.3 Western Blot实验 取液氮冻存的大鼠心肌组织，取液氮冻存的小鼠肝组织，加入冰浴的RIPA蛋白裂解液，冰上孵育30 min，收集溶解产物，12 000 r/min 4 ℃ 30 min离心；抽取上清，加入上样缓冲液，100 ℃ 5 min 蛋白变性；上样，以每孔20 μg量加入12.5% SDS-PAGE凝胶，100 V 2 h电泳，预处理PVDF膜及滤纸，半干法凝胶转膜，100 A 2 h，膜在TBS溶液洗 15 min；Blocking one封闭30 min，一抗以solution1按1∶1 000比例稀释，4 ℃孵育过夜，TBST(Tris缓冲液加吐温20)洗膜后二抗(1∶10 000)孵育，室温1 h。洗膜后加ECL发光液，室温反应1 min，凝胶成像系统成像，蛋白条带用Image J 7.0图像分析。

2 结 果

2.1 调脉饮及其拆方对乌头碱导致大鼠心电图的影响 与模型组相比，全方组、西药组大鼠出现VPB时间延长，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，全方组、凉血组、西药组出现VT时间延长，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，全方组、凉血组、西药组出现VF时间延长，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，全方组、凉血组、西药组出现CA时间延长，差异具有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图1。

表1 调脉饮及其拆方对快速心律失常大鼠心电图的影响(±s) s

图1 各组出现心律失常时间

2.2 调脉饮及其拆方对大鼠心肌LTCC β2mRNA的影响 与模型组相比，全方组、凉血组、西药组心肌LTCC β2mRNA表达降低，具有统计学意义(P<0.05)。详见表2、图2。

与模型组比较，*P<0.05图2 各组对LTCC β2 mRNA的影响

表2 调脉饮及其拆方对大鼠心肌LTCC β2 mRNA的影响(±s)

2.3 调脉饮及拆方对大鼠心肌LTCC β2蛋白表达的影响 与模型组相比，全方组、凉血组、西药组心肌LTCC β2蛋白表达显著降低(P<0.05)。详见表3、图3。

与模型组比较，*P<0.05图3 各组对LTCC β2蛋白表达的影响

表3 调脉饮及拆方对大鼠心肌LTCC β2 蛋白表达的影响(±s)

3 讨 论

调脉饮全方及凉血组可减少各种快速性心律失常的发生时间，降低心肌LTCC β2的mRNA的表达。L型钙通道是心肌细胞内钙离子浓度的重要调节者[9]，主要由α、β、γ和δ亚基组成，其中调节亚基β有4种亚型，仅β2在心肌中表达，它能使L型钙通道活性增强[10]。β2高表达会加速L 型钙通道激活，增加钙电流，促使细胞内Ca2+浓度迅速增高， 发生了钙超载， 导致L 型钙通道加速失活，L型钙通道电流降低，有效不应期缩短，促进快速性心律失常的发生[11]。

本研究结果显示，调脉饮全方及凉血组可减少各种快速性心律失常的发生时间，同时降低心肌LTCC β2的表达。因此，可以推测，调脉饮对快速性心律失常的治疗和预防作用与降低心肌LTCC β2的表达，降低L型钙通道活性，减少钙超载有关，其中，凉血组中药具有关键性作用。