橘皮酱油品质的研究

刘静怡，彭铭烨，付彩霞，付彬，钟晓凌，徐宁*

(1.湖北工业大学 湖北省食品发酵工程技术研究中心,武汉 430068；2.湖北土老憨调味食品股份有限公司，湖北 宜昌 443000)

酱油是世界上最古老的调味品之一，在中国已经使用了2500多年，是亚洲最受欢迎的调味品之一，它是以大豆(豆粕)、小麦(面粉)为原料，经米曲霉发酵制曲，在盐水中进行后发酵而成。随着人们生活水平的提高，越来越多的人们在寻求更好的酱油风味和营养。研究发现，酱油除了具有调味作用外，还具有营养保健功效[1-4]。酱油中含有天然的抗氧化物质，能显著降低自由基对人体的伤害，其抗氧化能力是维生素C和维生素E的十几倍。对酱油物质进行分析发现，其含有丰富的酚类物质，而酚类物质被公认具有一定的抗氧化能力。

柑橘在我国有较广的种植面积且产量巨大，是我国的主要水果之一。柑橘因富含维生素、矿物质、酚类化合物等营养物质而深受人们喜爱。目前，我国的柑橘加工业主要以柑橘果肉为主，大量的橘皮被直接丢弃，这不仅是资源的浪费，更会对环境造成污染。对橘皮的研究发现，橘皮中也含有大量的酚类物质，且其抗氧化能力与黄酮含量呈正相关。有研究人员发现橘皮精油有良好的抑菌作用，尤其是对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制作用非常显著，同时橘皮精油还有较强的自由基清除能力[5-13]。

本文以橘皮为辅料与传统酱油制曲原料混合，用米曲霉(沪酿3.042)发酵制曲，研究橘皮的添加对酱油质量指标、抗氧化活性、亚硝酸盐清除能力、酪氨酸酶抑制活性、黄酮含量、有机酸和风味物质的影响，以获得具有特殊风味的柑橘酱油。

1 材料与方法

1.1 原料

米曲霉(Aspergillusoryzae)AS 3.951(沪酿3.042)：湖北省食品发酵工程技术研究中心；豆粕、面粉、麸皮和橘皮：湖北土老憨调味食品股份有限公司。

1.2 仪器

UV-1601紫外/可见分光光度计 北京瑞利分析仪器有限公司；ZXJD-A430霉菌培养箱 上海智诚分析仪器制造有限公司； MLS-3781L-PC高压蒸汽灭菌器 松下健康医疗器械株式会社；UltiMate-3000高效液相色谱仪 美国Thermo公司；NL315SV-230冷冻干燥机 美国Avant公司。

1.3 试剂

芦丁(99%)、有机酸(色谱纯)、曲酸、L-多巴、酪氨酸酶：阿拉丁试剂(上海)有限公司；DPPH、ABTS：美国Sigma公司；其他化学试剂：均为化学纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 橘皮粉的制备

将新鲜的柑橘皮于-18 ℃下冷冻48 h，然后将柑橘皮置于冷冻干燥机托盘上，冷冻干燥24 h，最后将干燥后的柑橘皮进行粉碎并通过120目的网筛，得到橘皮粉。

1.4.2 制曲工艺

曲料配方：实验组A(米+橘)，豆粕∶面粉∶橘皮粉∶麸皮为6∶2.5∶1∶0.5，对照组采用面粉替代橘皮粉；实验组B(米+橘后)，制曲阶段与对照组相同，在对照组酱醪发酵的第1天加入曲料质量10%的橘粉。豆粕经浸泡后，115 ℃蒸压20 min，冷却后拌入面粉并接入种曲0.3%(W/W)，拌匀。制曲室34 ℃培养10～12 h，松曲1次。接着控温32～35 ℃，19～22 h第2次松曲。最后调节培养温度至28～30 ℃，保持该温度至40 h制曲结束。

1.4.3 发酵工艺

将1.4.2中制得的成曲与其2倍重量的盐水(18%NaCl)混合均匀，置于30 ℃的恒温培养箱中发酵120天。

1.4.4 样品的收集

在酱醪发酵的第120天收集发酵醪液，分析前所有样品均于-20 ℃条件下储存。

1.4.5 橘皮酱油指标的测定

氨基酸态氮和总酸的测定参照国家标准GB 5009.235-2016[14]；总氮的测定参考国家标准GB/T 5009.5-2003[15]中凯氏定氮法测定酱油中总氮的含量；还原糖含量的测定采用DNS比色法[16]。

1.4.6 橘皮酱油抗氧化活性的测定

1.4.6.1 DPPH自由基清除能力的测定[17]

精密量取稀释适当倍数的酱醪液0.4 mL，加入0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液7.6 mL，充分震荡摇匀，室温避光黑暗条件下静置30 min，然后使用紫外可见分光光度计测定517 nm处的吸光值，空白将用去离子水替换样液。

1.4.6.2 ABTS自由基清除能力的测定[18]

将25 mL的7 mmol/L ABTS+·溶液与440 μL的140 mmol/L过硫酸钾混合，置于暗处12～16 h，用磷酸盐缓冲液(10 mmol/L，pH 7.4)将ABTS+·溶液稀释至在波长734 nm处吸光度为0.70±0.02。将0.1 mL酱油稀释样品与4.9 mL ABTS+·溶液混合，摇匀后避光10 min后，在波长734 nm处测吸光度。

1.4.6.3 HRSA羟自由基清除能力的测定[19]

取9 mmol/L FeSO4溶液1.5 mL，9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1.5 mL和酱油稀释样品1.5 mL，混匀后，加入8.8 mmol/L H2O2溶液1.5 mL，摇匀，在37 ℃条件下水浴10 min，以蒸馏水代替水杨酸-乙醇溶液为样品调零，于510 nm波长处测定吸光度，用蒸馏水做空白对照组，在510 nm波长处测定吸光度。

1.4.6.4 亚硝酸盐清除能力

采用格里斯试剂比色法[20]。准确吸取40 μL酱油稀释样品于10 mL比色管中，加入1 mmol/L NaNO220 μL，再加0.1 mol/L HCl 140 μL，摇匀，37 ℃水浴放置1 h，加入1 mL 3%乙酸，摇匀，再加80 μL的格里斯试剂，摇匀，避光反应15 min，然后定容至刻度线，在520 nm处测定吸光值，同时做空白对照。

1.4.7 橘皮酱油酪氨酸酶抑制活性的测定

参照Wang等[21]的方法。

1.4.8 橘皮酱油多酚和黄酮含量的测定

参照Zheng等[22]的方法。

1.4.9 橘皮酱油有机酸的测定

有机酸的测定参照Park的研究方法[23]。

1.4.10 橘皮酱油风味物质的测定

酱油中挥发性风味物质的测定参照刘晶晶的研究采用GC-MS法[24]。

1.4.11 数据处理方法

3次实验结果采用平均值±标准差表示，使用SPSS及Origin软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 橘皮酱油的理化指标

在制曲或发酵中添加橘皮，对酱油的氨基酸态氮、总氮、总酸和还原糖的影响见表1。

表1 橘皮对酱油理化指标的影响

氨基酸态氮、总氮、总酸和还原糖是酱油的主要质量指标，对酱油风味的形成有着积极的作用。由表1可知，实验组A和B(橘皮添加时间不同)的氨基酸态氮和总氮无显著差异，总酸和还原糖差异显著。与对照组相比，实验组A、B的总酸含量分别提高了67.74%和37.63%，还原糖含量分别提高了20.36%和4.19%，氨基酸态氮含量分别降低了13.82%和17.07%，总氮含量分别降低了13.27%和14.22%。上述差异的原因可能是橘皮中含有大量的纤维素和果胶，经过纤维素酶和果胶酶的作用，显著提高了酱油中的酚酸物质及还原糖含量。

2.2 橘皮酱油的抗氧化活性研究

图1 橘皮对酱油抗氧化活性的影响

由图1可知，橘皮对酱油抗氧化活性的影响。两组实验组酱油的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和HRSA羟自由基清除能力均要强于对照组，分别增加了5.76%，1.40%，514.29%和434.57%，9.67%，3.44%。同时，制曲时添加橘皮(实验组A)对酱油的抗氧化活性提高幅度更大。

2.3 橘皮酱油的亚硝酸盐清除活性和酪氨酸酶抑制活性研究

图2 橘皮对酱油亚硝酸盐清除活性和酪氨酸酶抑制活性的影响

由图2可知，橘皮对酱油亚硝酸盐清除能力和酪氨酸酶抑制活性的影响。与对照组相比，实验组A、B的亚硝酸盐清除能力分别提高了66.75%和32.42%。同时，添加橘皮也使酱油的酪氨酸酶抑制活性增强，A、B两组酱油的酪氨酸酶抑制率分别提高了381.92%和208.91%。比较两组实验组，发现在制曲时添加橘皮对酱油的亚硝酸盐清除能力和酪氨酸酶抑制活性的提高幅度更大。

2.4 橘皮酱油多酚和黄酮含量的测定

由图3可知，3组酱油中黄酮和多酚的含量。通过比较3组酱油中的多酚和黄酮含量，可以发现橘皮的添加增加了酱油中黄酮和多酚的含量。与对照组相比，实验组A、B的多酚和黄酮含量分别提高了22.41%，134.32%和12.64%，84.62%。因此，添加橘皮能够明显提高酱油中多酚和黄酮的含量。

图3 橘皮对酱油多酚和黄酮含量的影响

2.5 橘皮酱油有机酸分析

有机酸能够影响酱油的酸味和甜味，从而对酱油的品质产生影响。

表2 橘皮酱油有机酸含量

由表2可知，3组酱油中均未检测出酒石酸，所含有机酸的种类相同，但在含量上有所不同。与对照组相比，实验组A、B中乳酸含量分别提高了19.13%，12.64%；柠檬酸含量分别提高了17.66%，8.78%；乙酸分别提高了9.84%，3.46%。而3组酱油的琥珀酸和L-苹果酸含量差别不大。

2.6 橘皮酱油风味分析

3组酱油的挥发性物质的种类和含量见表3。

表3 橘皮酱油挥发性物质含量

续 表

由表3可知，添加橘皮能够显著增加酱油的风味物质，且橘皮添加的阶段不同对酱油的风味也有明显的影响。总体上，实验组A、B的风味物质在种类和含量上显著高于对照组，其醇类、酯类、醛类、酸类、酚类和烯烃类等主要挥发性成分在种类和含量上都发生了变化。特别是酸类、酚类、酯类和烯烃类物质的含量有显著提高。这可能是由于酱曲中含有的丰富的酶系导致酱醪发酵阶段橘皮中挥发性活性成分不断释放到酱油中。

橘皮的添加显著提高了酱油中醇类物质的含量，尤其是苯乙醇在对照组(不加橘皮)酱油中未被检测到，而在实验组A、B两组酱油中均含有且含量较高，分别为180.26，141.03 ng/g。此外，橘皮的添加同时也提高了酱油中的乙醇含量，A、B两组酱油乙醇含量与对照组相比分别提高了75.89%，54.98%。由于橘皮中含有大量挥发性酸味物质，因此添加橘皮的酱油中乙酸含量明显增加，同时显著减少了2-氨基-6-甲基苯甲酸含量。对照组酱油中未被检测到烯烃类物质，而在实验组中均检测到4种烯烃类物质，分别为α-蒎烯、双戊烯、香橙烯和D-柠烯，这是由于成熟水果的果皮中都含有一定量的烯烃类物质。这些烯烃类物质可赋予酱油柑橘香味，同时还能提高酱油的品质。此外，橘皮的添加还使得实验组A、B两组酱油中乙酸乙酯的含量较对照组分别提高了328.85%，245.66%，使酱油具有浓郁的酯香味。

根据表3的数据分析还可发现，橘皮添加阶段(制曲或发酵)不同，其酱油中的挥发性物质的含量也有所区别，如乙醇、乙酸和烯烃类物质均是实验组A(制曲时添加橘皮)要高于实验组B(发酵时添加橘皮)。总的来说，在制曲阶段添加橘皮更有助于酱油风味的形成。

3 讨论

本文主要研究了橘皮对酱油品质的影响，并比较了在不同阶段(制曲、发酵)添加橘皮所得到的酱油的各项指标。通过对比橘皮添加对酱油的影响，分析了橘皮酱油的质量指标、抗氧化活性、有机酸、黄酮和挥发性风味物质与传统酿造酱油的差异。橘皮添加对酱油的氨基酸态氮和总氮无显著影响，总酸和还原糖受橘皮添加时间影响比较显著。与传统酱油相比，橘皮酱油的总酸、还原糖含量分别提高了67.74%，20.36%。并且橘皮的添加能够显著增强酱油的抗氧化活性、亚硝酸盐清除能力和酪氨酸酶抑制活性。总体上橘皮酱油中风味物质在种类和含量上显著高于传统酱油，其醇类、酯类、醛类、酸类、酚类和烯烃类等主要挥发性成分在种类和含量上都发生了变化。特别是酸类、酚类、酯类和烯烃类物质的含量有显著提高。这可能是由于酱曲中含有的丰富的酶系导致酱醪发酵阶段橘皮中挥发性活性成分不断释放到酱油中。对比橘皮添加阶段的不同，可以发现：在制曲阶段添加橘皮更能显著提高酱油的品质，增强酱油的抗氧化活性以及更有助于酱油风味的形成。