3种香辛料提取物抑菌及挥发性成分的研究

孟君，彭秀丽，张峻松，罗立强

(1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院, 郑州 450002；2.食品生产与安全河南省协同创新中心，郑州 450002；3.郑州铁路职业技术学院 药学系，郑州 451460；4.上海大学 化学系，上海 200444)

八角、辣椒、花椒属于天然食用香辛料，它们是常见的调味品,与人们的生活息息相关，富含大量的营养成分，是一类含有各种挥发性香气成分，能赋予食品香味的天然物质。

八角(Illiciumverum)又名大茴香，是木兰科八角属植物，其干燥成熟果实为我国的特产香辛料和中药，也是居家必备的调料[1]。八角在食品调味料中占据着极其重要的地位，已作为香辛料在中国使用数百年，用作增香矫味和调制卤汤，深受消费者喜爱，被称为“饮食行业的大料”[2-4]。近年来的研究表明，其具有较好的抑菌、杀虫活性和抗自由基氧化作用[5，6]

辣椒为茄科植物辣椒(CapsicumfrutescensL.)的果实，其作为食品和药品应用已有几个世纪[7]。辣椒中含有多种有效成分如色素、辣椒碱、维生素、有机酸、蛋白质、糖和矿物质等[8]。现代药理研究表明：辣椒提取液具有广泛的抑菌活性，辣椒素就是其中最主要的辣味物质和活性成分[9]。

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)为芸香科落叶灌木或小乔木蜀椒的果实，被誉为“八大调味品”之一，花椒中含有丰富的生物活性物质，是中国、日本和东南亚国家和地区食品工业、餐饮业和家庭烹饪常用的香辛调味料和中药配料[10]。《中华人民共和国药典》中规定花椒为传统中药， 记载它有“温中止痛、杀虫止痒”的功效[11]。

随着食品工业的发展和人们对食品安全和营养要求的提高，以食品抑菌、防腐为目的的研究不断深入，由于化学抗菌剂的安全性受到挑战，天然的食品添加剂凭借着具有化学合成剂无法比拟的安全优势，越来越被推崇。寻找广谱、高效、无毒、天然的新型食品防腐剂已成为当前食品添加剂研究的主流[12]。而植物和香辛料长久以来一直被中医用于预防或治疗传染病，西医也正在尝试着把它们应用于治疗中。关于药用植物和香辛料的抗微生物活性的研究已经成为一种趋势[13]，从香辛料中提取有效成分作为食品天然防腐剂具有广阔的前景。本文研究八角、辣椒、花椒3种提取物对所选对象菌的抑菌效果，并对它们的挥发性化学成分进行鉴定分析， 以期为香辛料作为食品天然防腐剂的开发提供一定的理论依据。

1 实验材料与仪器

1.1 材料、试剂与方法

1.1.1 材料

八角、红辣椒、花椒：为市售干制品，购于郑州市金水区一家人超市。

菌种：大肠杆菌(Escherichiacoli)；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，由郑州轻工业学院食品与生物工程学院生物工程实验室提供。

1.1.2 主要试剂

无水乙醇、无水硫酸钠、氢氧化钠、NaCl(氯化钠) (均为AR)：天津市德恩化学试剂有限公司；牛肉浸膏、蛋白胨、琼脂粉(均为BR)：北京双旋微生物培养基制品厂。

1.2 主要仪器

ZN-500A粉碎机 常州日宏粉体设备厂；DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；HH-S4数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂；SHB-3循环水式多用真空泵 郑州杜甫仪器厂；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；LX-C35立式自动电热压力蒸汽灭菌锅 合肥华泰医疗设备有限公司；SW-CJ-IFD净化工作台 苏州净化设备有限公司；HZC-250全温振荡培养箱 太仓市实验设备厂；JY1001电子天平 上海浦春计量仪器有限公司；GC6890-5973MS气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的提取

将干八角、花椒、红辣椒先在40 ℃干燥4 h，用粉碎机粉碎，分别称取干八角、花椒、辣椒粉末50 g放入500 mL的圆底烧瓶内，加入200 mL的无水乙醇，78 ℃回流提取4 h。抽滤得滤液，转移至500 mL的圆底烧瓶内，用旋转蒸发器进行真空浓缩(40 ℃，0.08 MPa)，蒸出乙醇，得到一定体积的浓缩液，加入少量的无水硫酸钠，于4℃冰箱中干燥过夜，保藏备用。

1.3.2 培养基的制备

牛肉膏、蛋白胨、琼脂培养基，其中的牛肉膏为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。

牛肉膏、蛋白胨、琼脂培养基配方：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.4～7.6，121 ℃ 灭菌20 min。

1.3.3 供试菌种的活化

将经高压蒸汽灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基在无菌培养皿中制成平板，待培养基凝固后，分别用接种环按无菌操作进行平板划线：大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)用牛肉膏蛋白胨培养，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h，放入-4 ℃冰箱内储藏备用。

1.3.4 供试菌悬液的制备

把2个经高压灭菌的装有50 mL液体培养基的250 mL的三角瓶放入超净工作台，打开超净工作台紫外线灯照射15 min，关闭紫外线灯，打开白炽灯和风机。分别挑取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌单菌落接种于液体培养基。37 ℃，180 r/min恒温摇床培养5 h，得菌悬液，放入4 ℃冰箱内保藏待用。

1.3.5 含菌双叠平板的制备

待预先准备好，并经高温高压(121 ℃，20 min)灭菌的培养基温度降到50～60 ℃时，将制备好的菌悬液倒入培养基中(菌悬液与培养基的体积比为1∶20)，充分混合均匀，制成含菌双碟平板，冷却备用。

1.3.6 抑菌效力的测定

牛津杯法：将牛津杯、移液枪头、镊子等器皿灭菌后，于超净工作台内，用无菌镊子把牛津杯置于含菌平板表面，再分别吸取八角、花椒、辣椒乙醇提取液50 μL注入牛津杯中，每种菌设置3个平行。然后将平皿置于37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h。按时取出，测量抑菌圈直径，数据取平均值。

判断标准：牛津杯直径为8 mm，抑菌圈直径大于9 mm才被评价为有抑菌效果。

1.3.7 八角提取液的GC-MS分析

取适量上述制备的2种样品提取液，分别放于试管中，加入适量的无水硫酸钠，放置过夜后，以无水硫酸钠不结块为宜，过滤，取适量干燥过滤后的八角、花椒、辣椒提取液，用GC-MS分析提取液中挥发性有机成分。

1.3.7.1 GC条件

柱子类型：HP-5MS(60 m×0.25 mm,0.25 μm)；升温程序：50 ℃保持3 min，以4 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；进样口温度：260 ℃；传输线：270 ℃；分流比：5∶1；进样体积：1 μL；溶剂延迟时间：6 min。

1.3.7.2 MS条件

EI源电子能量70 eV，电子倍增器电压1650 eV，质量扫描范围：30～550 amu，离子源温度230 ℃，四极杆温度130 ℃，对采集到的质谱图采用GC-MS计算机联机分析法，与谱库Nist02对比分析鉴定各成分。

2 结果与讨论

2.1 八角、辣椒、花椒提取物对3种菌的抑制作用

采用牛津杯法，以上述几种辛辣调味料的乙醇提取液分别测定对3种菌的抑菌作用，不同辛辣调味料对3种菌抑菌性的具体抑菌平板效果图见图1～图3。用尺子量得各抑菌圈的直径大小，得出3种调味料的乙醇提取物对3种细菌的抑菌活性，见表1。

图1 八角、辣椒、花椒提取液对大肠杆菌的抑菌作用

图2 八角、辣椒、花椒提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌作用

图3 八角、辣椒、花椒提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

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由表1可知，八角乙醇提取液对供试菌株的生长具有较好的抑制作用，其中，对金黄色葡萄球菌的抑制作用最好；辣椒乙醇提取液只对金黄色葡萄球菌有抑制作用；花椒乙醇提取液无抑菌作用。

2.2 八角挥发性成分分析

将1.3.1制得对花椒、八角、辣椒的提取物，经GC-MS分析，得到样品的总离子流色谱图和各峰质谱图，经数据库检索，采用计算机对各峰的质谱图进行Nist标准谱库的检索，根据质谱裂解规律进行核对，参考标准图谱和相关文献确定其化学结构。对各色谱峰进行面积积分得到各峰面积的相对含量。选取比配度大于38%的数据，分离鉴定出了八角、辣椒、花椒主要挥发性成分，结果见表2～表4。

表2 八角主要挥发性香气成分及含量

注：本表显示的是比配度大于38的数据。

由表2可知，八角中的挥发性香气成分比较复杂，酮、醛、酸、酯、酚、醚等，其中仅茴香脑就占一半以上，面积百分比为59.4568%。此外，所鉴定的成分中存在较多的同分异构体，如顺式-13-硬脂酸和反式-13-硬脂酸、油酸和反油酸。

表3 辣椒主要挥发性香气成分及含量

注：本表显示的是比配度大于38的数据。

由表3可知，辣椒中的挥发性香气成分含量最高的也是茴香脑(22.7613%)；其次为顺-11-十八碳烯酸(17.2643%)。油酸、亚油酸是自始至终都有的成分。此外，还含有一个特征成分——辣椒素(12.5766%)。

表4 花椒主要挥发性香气成分及含量

续 表

由表4可知，花椒中的挥发性香气成分主要为低分子量的烷烃和烯烃，其中1-己烷含量最高，面积百分比为23.2288%；其次为3-甲基己烷，面积百分比为18.6205%；其次为2，3，4-三甲基正己烷(10.6317%)；其次为2，2-二甲基丁烷(8.7596%)； 其次为正庚烷(7.9338%)，这5种物质的总含量达到69.1744%。此外，还含有4.1965%的茴香脑。

3 结论

本文采用普通蒸馏法，以乙醇为提取剂，对3种常见的辛辣调味料花椒、八角、辣椒进行提取，以乙醇提取物对3种常见的细菌做了抑菌性实验，结果表明：八角乙醇提取液对供试菌株均有较好的抑制作用，其中，对金黄色葡萄球菌的抑制作用最好；辣椒乙醇提取液对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用；花椒乙醇提取液对3种供试菌均无抑制作用。

通过GC-MS分析提取物的主要香气成分，共分离鉴定出八角、花椒中的主要挥发性化合物各有27种。八角中含有较多的同分异构体，主要挥发性香气成分中，茴香脑的相对质量占总成分的一半以上。花椒提取物中茴香脑的相对含量的4.1965%，有机成分中大多以低分子量的烷烯为主；辣椒提取液中的挥发性主要有机成分有30种，含量最高的也是茴香脑，其相对含量为22.7613%，辣椒中含有较高特有活性成分辣椒素，活性成分辣椒素的相对含量为12.5766%。Rohloff等14]从八角中分离得到茴香脑及其有效物质，即[3R-(3,4,5)]-3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸物质，对伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和大肠杆菌等有较强的抑制作用。3种提取物中都含有一定量的茴香脑，其中八角中的含量最高，辣椒次之，花椒最少，从3种提取物的抑菌性来看，八角乙醇提取物对3种细菌都有抑制作用，辣椒提取物只对金黄色葡萄球菌有抑制作用，花椒提取物的抑菌作用不明显，由此可推断，茴香脑可能是这几种调味料具有抑菌活性的主要活性物质。提取物中具体是哪些成分具有抑菌活性还不是很清楚，对此，还需要进一步加强对其抑菌活性物质的分离鉴定及应用研究。

“民以食为天，食以味为先”，随着食品工业的快速发展和消费者对“保健、安全、回归自然”饮食意识的不断加强[15]，八角、辣椒、花椒作为重要的天然调味料，挥发性香气成分较多，八角、辣椒具有一定的抑菌作用，这种无毒无副作用的辛辣调味品作为防腐剂具有广阔的开发与应用前景，该研究为香辛料资源在食品天然防腐剂中的开发利用提供了理论依据和支持。