乳酸菌计数结果的比较研究

王 杰, 郑亦舟, 姜 凯, 施凡凡, 袁静芸, 王静彦,赵 渝*, 矫 强

(1.上海师范大学 生命科学学院 植物种质资源开发协同创新中心,上海 200234;2.上海市质量监督检验技术研究院,上海 201114; 3.上海师范大学附属中学,上海 200124;4.贝克曼库儿特商贸(中国)有限公司,上海 200235)

0 引 言

流式细胞术(FCM)具有检测速度快,收集数据量大,分析全面,方法灵活等特点,已经成为液体商品生产企业用来进行微生物在线监测、产品质量监控的重要手段[1],也被应用于乳制品、饮料、化妆品、制药等工业领域[2].相较于传统的平板计数法[3],FCM所用实验样品体积极小,操作方法简便,检测结果一致性较好[4].流式细胞仪由液流系统、光学检测系统、数据存储及分析系统构成.进行FCM测量时,采用前向和侧向两种方向的散射光进行基本的判定和选择,前向散射光可以区别细胞大小,侧向散射光可以区分细胞内部结构的复杂程度,进而初步区分细胞与其他非生物颗粒,选出目标细胞群落.但对于大小与细胞相差不多的干扰颗粒还需借助荧光染料染色,根据荧光信号进一步区分测试.FCM无需对细胞进行增菌,可直接对单个细胞进行计数,能够检测活性细胞的比例以及总菌数,还能对菌种的质量进行评估[5].本文作者以市售发酵乳饮料及发酵乳中的乳酸菌作为研究对象,利用FCM对乳酸菌活菌数进行计数,并将计数结果与平板计数法所得结果进行比对,以期为产品储藏时间较短,放行压力较大的乳制品产业提供一种可行的检测方法和手段.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验样品

本实验所用发酵乳饮料和发酵乳均为市售产品,6份发酵乳样品分别编号为R1～R6,10份发酵乳饮料样品编号为Y1～Y10(为了避免产生影响,此处不列出样品厂商与型号),重现性实验中相同浓度的保加利亚乳杆菌悬液分别编号为1～10.

1.1.2 实验试剂

核酸染色剂(SYTO©24溶液,碘化丙锭PI):Thermofisher 公司;乳酸菌(MRS)肉汤:Thermofisher 公司;MRS琼脂:Thermofisher 公司;乳酸链球菌琼脂(M17):青岛海博生物技术有限公司;MC培养基:青岛海博生物技术有限公司;营养肉汤(NB):青岛海博生物技术有限公司.

1.1.3 工作液

将100 mg PI溶于1000 mL超纯水,得到质量浓度为0.1 mg·mL-1的PI工作液(PI质量分数需控制在0.002%的潜在毒性以下).

将物质的量浓度为5 mmol·L-1的SYTO©24溶液用超纯水稀释,得到物质的量浓度为0.1 mmol·L-1的SYTO©24工作液;

将9 g NaCl晶体,795 mg Na2HPO4·7H2O,144 mg KH2PO4溶于1000 mL超纯水中,调节pH值至7.4±0.5,121 ℃下灭菌20 min,得到磷酸缓冲盐溶液(PBS).

1.1.4 实验仪器

流式细胞仪(CytoFLEXS):贝克曼库尔特商贸有限公司;均质拍打器 (JT-10):杭州聚同电子有限公司;生物安全柜 (ZHJH-C1109B):上海智城分析仪器制造有限公司;灭菌锅(LDZF30KBII):上海申安医疗器械厂;电热恒温培养箱 (DHP-9015B):上海一恒科学仪器有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 FCM的重现性

取保加利亚乳杆菌粉溶解于PBS中配制成相同浓度的菌悬液各100 μL,分别加入5 μL PI工作液和5 μL SYTO©24工作液,在37 ℃下孵育3 min后上机(流式细胞仪)检测,该步骤重复10次,计算变异系数

(1)

其中,S为标准偏差,M为平均数.

1.2.2 样品前处理

对发酵乳制品样品(发酵乳饮料或发酵乳)进行稀释后直接上样,上样结果如图1所示,其中,ASSC为侧向散射光强度,AFSC为前向散射光强度,AFITC为绿色荧光通道荧光强度.在散射光通道,发酵乳制品中的干扰比较严重,杂质颗粒的侧向散射光强度较高,如图1(a)所示.而在荧光通道,细菌颗粒和杂质颗粒能被很好地区分,这是因为杂质颗粒不具备生物活性,所以无法与荧光染料结合,而细菌颗粒结合了荧光染料之后,会发出特定波长的荧光信号,如图1(b)所示.因此酵乳制品样品只需要进行稀释即可上机检测.

图1 发酵乳制品样品上样结果

1.2.3 乳酸菌的计数

分别利用FCM、平板计数法对各样品进行计数,并对比计数结果.

1) FCM.取25 g样品加入225 mL灭菌PBS缓冲液中,用均质拍打器拍打1～2 min,然后进行梯度稀释,取100 μL的稀释液,加入10 μL的PI工作液和10 μL的SYTO©24工作液,再用灭菌PBS缓冲液定容到1 mL,在37 ℃下避光染色和孵育3 min后,上样读取120 s.用流式细胞仪圈出SYTO阳性,PI阴性区域作为活菌计数群落,读取所圈门内的活菌颗粒数,乘以稀释倍数,即得到样品中的活菌颗粒数.每个样品做3次平行实验,以其平均数作为计数结果.

2) 平板计数法.取25 g样品加入225 mL灭菌生理盐水中,按照菌种的添加量适当稀释后,取1 mL 连续梯度(2～3个)的稀释液,加入空的平皿中,倒入15 mL MC培养基,在37 ℃下培养72 h,挑取红色菌落进行计数,此为嗜热链球菌数.再从上述稀释液中取1 mL,加入空的平皿,倒入MRS培养基15 mL,在37 ℃下培养72 h并计数,此为保加利亚乳杆菌数.乳酸菌的总数为嗜热链球菌菌数和保加利亚乳杆菌菌数之和,每个稀释度的平皿做2次平行实验,以其平均数作为计数结果.

2 结果与分析

2.1 流式细胞仪的重现性结果

流式细胞仪的重现性结果如表1所示.

表1 流式细胞仪的重现性结果

由表1可知,在相同的细胞浓度和实验条件下,活性细菌的变异率为3.46%,非活性细菌的变异率为3.56%,均在5.00%以内,具有较好的重现性.

2.2 发酵乳饮料中FCM与平板计数法活菌计数对比

市售发酵乳饮料中活菌用FCM和平板计数法计数结果如表2所示.

表2 市售发酵乳饮料中活菌用流式细胞法和平板计数法计数结果

注:-表示产品标签未标注,数据按照国标方法(n=2)计算得出,最终结果为2次平行实验结果的算术平均,下同

发酵乳饮料中添加的都是活菌FCM和平板计数法检测结果间存在较显著的相关性(P=0.9014).

2.3 发酵乳中FCM与平板计数法活菌计数对比

市售发酵乳中活菌用FCM和平板计数法计数结果如表3所示.

表3 市售发酵乳中活菌用FCM和平板计数法计数结果

发酵乳样品中R4、R6、R8 三个样品为灭菌型发酵乳,通过平板计数法未检出菌落,但是用FCM检出了非活性的菌落群体.而活菌型的发酵乳产品的各组中,两种方法的检测结果也呈现明显的相关性(P=0.9653).

使用FCM和平板计数法对发酵乳制品中的乳酸菌进行计数,比较计数结果,两者之间呈现明显的正相关,且流式细胞术的计数结果略高于平板计数法,其主要原因是FCM是对单个细菌颗粒进行计数,而平板计数法是对可培养的细菌形成的菌落进行计数,理论上FCM的计数精确度高于平板计数法.

流式细胞术是非特异性的检测方法,在食品生产监测中的应用越来越广泛.在本研究的检测结果中还包含了除乳酸菌以外的其他细菌的数量,虽然乳酸菌的代谢产物——乳酸会抑制一部分微生物的生长,但是不排除有其他耐酸性微生物生长的情况,如何提高检测的特异性,如何对不同微生物进行区分,还有待进一步研究.

3 结 论

通过染色剂膜透性的差异将发酵乳及发酵乳制品中的活性乳酸菌和非活性乳酸菌加以区分,再经过FCM的荧光检测分别得到活性和非活性乳酸菌的数量,达到对发酵乳制品中活菌进行计数的目的.将FCM计数结果与平板计数法结果相比较,结果发现两者之间有明显的正相关性,说明流式细胞仪对于细菌活性判定具有准确性,可以作为一种对活性乳酸菌快速计数的有效方法.该方法克服了传统培养法工作量大,培养时间长,计数结果不稳定且只能计算活菌的缺点,为产品储藏时间较短,放行压力较大的乳制品产业提供了一种快速可行的检测方法.