上海菠菜霜霉病菌生理小种鉴定及分子检测

蔡晓锋, 郁征宇, 王小丽, 徐晨曦, 葛晨辉, 王 水, 王全华

(上海师范大学 生命科学学院 植物种质资源开发协同创新中心,上海 200234)

菠菜(SpinaciaoleraceaL.)属于苋科菠菜属植物[1],是一种重要的深绿色叶用蔬菜,具有很高的营养价值,并逐渐被列入健康饮食菜单[2].菠菜适应性强,栽培广泛,是上海市民餐桌上最常见的绿叶菜类蔬菜之一,也是补充上海市蔬菜市场淡季的主要绿叶菜品种之一.上海地区菠菜栽培多为设施大棚栽培,且栽培密度高,在春初和秋冬栽培过程中低温高湿、种植密度大等因素经常导致菠菜霜霉病爆发,给种植者造成重大的损失.菠菜霜霉病(Peronosporafarinosaf.sp.Spinaciae,Pfs)是由专性寄生菌引起的气传真菌病害[3],主要危害植株叶片,苗期和成株期均可发生,严重影响菠菜的产量和品质,降低经济效益.菠菜霜霉病菌是专性寄生真菌,不同地区存在着生理小种分化现象.菠菜霜霉病菌首次报道于1800年,但直到1991年才鉴定出4个菠菜霜霉病菌生理小种[4];而在接下来的20年间鉴定出10个霜霉病菌生理小种[5-6].到目前为止,已经分离鉴定出16个菠菜霜霉病菌生理小种[2,7].Irish等[5-6]建立了菠菜霜霉病菌生理小种鉴定的标准方法和鉴别寄主.菠菜霜霉病菌鉴别寄主含有不同的抗性位点,因此可以对菠菜霜霉病菌以及新的生理小种进行鉴定分析,为针对不同地区不同生理小种进行有目的的抗病育种工作奠定了基础.目前美国、日本和欧洲各国的菠菜霜霉病菌生理小种陆续被鉴定出来,而中国菠菜霜霉病菌生理小种鉴定还刚刚起步.范桂彦等[8]利用10个菠菜霜霉病菌鉴别寄主鉴定了北京、山东和山西的5个菠菜霜霉病菌生理小种,结果表明北京的霜霉病菌样品为9号生理小种,山东霜霉病菌样品为8号生理小种,山西霜霉病菌样品为5号生理小种.

真菌的分类鉴定主要以真菌的形态学和分子生物学手段进行,核糖rDNA内部转录间隔区(ITS)序列分析技术是常用的分子生物学方法.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增病原菌核糖体ITS基因区段进行真菌鉴定、检测及病害诊断的方法因其快速、准确、简便而得到迅速发展.目前只有新疆地区利用ITS技术快速检测出菠菜霜霉病菌[9].本研究基于菠菜霜霉病菌生理小种鉴别寄主系统,对采集自上海地区的菠菜霜霉病菌生理小种进行鉴定;利用ITS通用引物扩增ITS序列,并对ITS序列进行生物信息学分析,以期明确该区域生理小种分化,为菠菜抗霜霉病育种提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

菠菜霜霉病菌生理小种鉴别寄主为9份菠菜栽培品种,由美国阿肯色大学提供.参试的菠菜霜霉病菌样品共2份,分别采集于上海地区2017年春季和秋季发病设施大棚内,采集后的新鲜带菌叶片和正常叶片直接放入保鲜袋中,于-20 ℃低温保存备用,使用前接种于感病菠菜材料上.

1.2 接种方法及鉴定

2017年11月,将9份鉴别寄主播种于上海师范大学奉贤校区生物基地的玻璃温室中,穴盘育苗,在植株长出3～5片真叶时定植于培养槽和营养钵中,分别种植于玻璃温室和人工气候室,参考文献[10]的方法进行菠菜霜霉病菌接种.用毛刷将霜霉病菌从感病菠菜叶片上刷下,制成孢子悬浮液,孢子浓度约为105mL-1,用喷壶均匀地喷于鉴别寄主植株叶片上,以喷清水的叶片作对照,每份鉴别寄主接种10株,重复3次.接种后,先将植株在温度18 ℃、湿度96%条件下保湿24 h;然后置于温度18～20 ℃、湿度75%、光照强度8500 lx 条件的人工气候室中光照生长12 h;玻璃温室培养槽中连续喷施3～5 d,喷施后封闭温室,保持湿度在50%～60%范围内.

根据菠菜植株叶片上霜霉病的发病情况统计每个鉴别寄主的抗感状况,植株叶片上有明显可见的白色霜霉病菌或灰色霜霉层或淡黄色感病病斑者为感病菠菜,植株叶片无上述症状者为抗病菠菜.鉴别寄主植株发病率<15%即为抗病,>85%即为感病,在15%～85%之间则说明该病样为混合生理小种[10].根据霜霉病菌在9份鉴别寄主上的抗、感反应确定生理小种.

1.3 序列扩增、克隆及测序

利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取菠菜霜霉病感病和正常叶片基因组DNA,使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测核酸的浓度和质量.采用真菌核糖ITS区通用引物ITS1/ITS4对提取的核酸进行扩增,引物序列如下:

ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′.

PCR反应体系总体积为15 μL,包含1×10缓冲液(含Mg2+)1.5 μL,物质量浓度为10 μmol·L-1的正反向引物各0.3 μL,物质的量浓度为0.25μmol·L-1的三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)0.3 μL,生物量浓度为0.05 U·μL-1的水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶 0.1 μL,模板DNA 1 μL,双蒸水11.5 μL.PCR程序为:在94 ℃温度下预变性5 min,在94 ℃温度下变性30 s,在56 ℃温度下退火30 s,在72 ℃温度下延伸45 s,共进行35个循环,再在72 ℃温度下延伸10 min.将PCR产物在质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶,1×TAE电泳缓冲液,100 V电压条件下电泳30 min,置凝胶成像系统中观察分析.将PCR产物与pEASY-Blunt载体连接,然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经过挑菌和M13通用引物PCR检测后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序.

1.4 序列生物信息学分析

利用Multalin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)和Geneious进行系统进化树分析多重序列比对[11];利用MEGA4软件构建邻近法(NJ)系统进化树[12],参数为软件默认值:泊松校正、随机种子系统测验和成对删除[13].采用重复1000次的自举法检验构建进化树的可靠性,自举率大于50%的分支被认为是可靠的结果,并生成对应的图片格式.

2 结果与分析

2.1 菠菜霜霉病菌生理小种鉴定

在人工气候室进行霜霉病菌生理小种接种5 d后,试样开始陆续出现发病现象,8 d后不再出现新的发病症状,结束试验并统计发病状况,划分反应类型;在玻璃温室进行霜霉病菌生理小种接种的试样,于23 d后开始出现发病现象,35 d后不再出现新的发病症状,结束试验并统计发病状况,划分反应类型.结果表明:玻璃温室接种试样抗病性鉴定结果和人工气候室的鉴定结果一致,但发病情况轻于室内接种鉴定结果.结合菠菜霜霉病菌生理小种鉴别系统(表1)[5-6]对2份样品进行鉴定,结果表明,采自上海的2份菠菜霜霉病菌样品(SH-1、SH-2)均为9号生理小种(表2).

表1 菠菜霜霉病菌生理小种鉴别系统

注:+ 代表感病反应,- 代表抗病反应,下同

表2 菠菜霜霉病菌生理小种鉴别结果

2.2 ITS序列克隆及测序

采用ITS1和ITS4通用引物分别对菠菜正常叶片和霜霉病感病叶片的DNA进行PCR扩增,产物用1.5%(质量分数)琼脂糖凝胶做电泳检测.结果表明,在菠菜霜霉病感病叶片中可以扩增出2条条带,分别为700 bp和900 bp左右的条带,同样在菠菜霜霉病感病植株附近的正常抗病菠菜叶片中也可以分别扩增出700 bp和900 bp左右的条带,而在人工气候室的正常菠菜叶片中可以扩增出一条700 bp左右的条带(图1).

将菠菜霜霉病感病叶片中扩增的2条条带分别回收,然后连接pEASY-Blunt载体并转化大肠杆菌,菌液PCR检测结果表明在重组质粒菌液中可以分别扩增出900 bp和1100 bp左右的条带(利用载体上M13测序引物扩增,包括载体片段200 bp)(图2),将PCR阳性菌液送去测序.

图1 ITS1/ITS4引物扩增结果(M为Trans2K Plus DNA Marker;1～5为菠菜霜霉病感病植株叶片DNA;7～8为菠菜霜霉病感病植株附近的抗病植株叶片DNA;9～12为在人工气候室培养的正常菠菜叶片DNA)

图2 菠菜霜霉病菌重组质粒PCR检测结果(M为Trans2K Plus DNA Marker;3～17为900 bp片段重组质粒菌液PCR检测结果;1～2为700 bp片段重组质粒菌液PCR检测结果)

2.3 ITS序列生物信息学分析

测序结果表明900 bp左右的条带实际大小为887 bp,700 bp左右的条带实际大小为739 bp.在美国国立生物技术信息中心(NCBI)进行BLAST比对分析发现887 bp条带为霜霉病病原菌ITS序列,并命名为PFS-SP,739 bp的条带为菠菜热激转录因子.将PFS-SP序列和21条从NCBI上下载的其他霜霉病病原菌ITS序列进行相似性比较,发现上海菠菜霜霉病病原菌ITS序列PFS-SP与Peronosporaeffusa(AF528560.1)相似性最高,为99.4%.多重序列比对和系统进化树结果表明PFS-SP与Peronosporaeffusa具有很高的同源性,与Peronosporafarinosa(FM863725.2)、Peronosporarumicis(AF465758.1)和Peronosporaboni-henrici(FM863712.2和FM863714.2)具有较高的同源性,并聚在同一个分支(图3).

图3 根据ITS基因序列构建的系统发育树

3 结 论

采集了上海的2份菠菜霜霉病菌生理小种,经过鉴定均属于9号生理小种,与范桂彦等[8]鉴定的来自于北京的3份霜霉病病样相同.由于菠菜霜霉病病原菌可以通过种子传播,而我国的菠菜生产中国外种子的使用比例很高,这很有可能是9号生理小种在北京和上海均有发现的原因.利用ITS通用引物ITS1/ITS4在菠菜霜霉病感病叶片DNA中扩增出887 bp的条带,序列分析表明其属于菠菜霜霉病属(Peronosporaeffusa),与NCBI中已有的序列AF528560.1具有很高的相似性.此外利用通用引物ITS1/ITS4还可以实现快速对菠菜霜霉病样品的检测.