HPLC法测定大鼠血浆中胆红素的含量

柳庆坤 徐 滨 任小荣 齐永秀 李远方 李 珂

(1.泰山医学院药学院，山东 泰安 271016； 2.泰安市食品药品检验检测中心，山东 泰安 271000)

胆红素是胆色素的一种，它是血红蛋白分解代谢后的还原产物。胆红素的一般定量分析方法有重氮法、分光光度法、荧光法及高效液相色谱法等。严克东等采用重氮化试剂显色法测定，测得样品中的总胆红素含量。王颖等[1]采用双波长紫外分光光度法测定天然牛黄中胆红素的含量。吴韵铭[2]利用铜离子在碱性条件下催化氧化胆红素并与其氧化产物胆绿素形成蓝色配合物的原理，建立了流动注射分光光度法测定人工牛黄中胆红素。范存霞等[3]用HPLC法测定氨金黄敏颗粒中胆红素含量，于如海等[4]利用HPLC测定复方氨酚烷胺颗粒中人工牛黄的含量，朱孝芸等[5]采用HPLC法对进口牛黄、国产牛黄、人工牛黄和培植牛黄中的胆红素进行测定。但对血浆中胆红素的含量测定方法未见报道。

本研究采用HPLC法建立了大鼠血浆中胆红素的含量测定方法，分离效率高，专属性强，灵敏度高。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

LC-10AT型日本岛津高效液相色谱仪、SPD-10A型紫外分光度计[岛津仪器(苏州)有限公司]；KQ-500E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HANGPING FA1004电子分析天平(上海新科仪器厂)；AP-01P真空泵(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；微孔滤膜(上海市新亚净化器件厂)；高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；移液枪(10～100μl、100～1000 μl)；过滤器(上海沪西分析仪器厂)。

1.2 材料和试剂

胆红素标准品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号：10077-200604)；甲醇色谱纯(山东禹王实业有限公司禹城化工厂；天津市永大化学试剂开发中心)；二甲基亚砜分析纯(天津市广成化学试剂有限公司)；冰乙酸分析纯(天津市巴斯夫化工有限公司)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；二氯甲烷分析纯(天津市博迪化工有限公司)，氯仿分析纯(天津市博迪化工有限公司)。

2 实验方法与结果

2.1 标准贮备液的制备

精密称取胆红素对照品5.6 mg置10 ml棕色容量瓶中，加二甲基亚砜使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 样品预处理

取待测血浆50 μl，加入150 μl甲醇，旋涡1 min，离心10 min(12000 r/min)，取20 μl上清液进样分析。

2.3 色谱条件

色谱柱：依利特Hpersil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测波长为455 nm，流动相为甲醇-1%醋酸(95∶5)，流速为1.0 ml·min-1，进样量为20 μl。

2.4 方法的专属性试验

色谱柱：Hpersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)(杭州格图科技有限公司)；流动相：甲醇-1%醋酸溶液(95∶5)；流速：1.0 ml·min-1；检测波长：455 nm。在此条件下，分别进二甲基亚砜空白、胆红素标准液、空白血浆、胆红素-血浆，二甲基亚砜的色谱峰保留时间为3.173、3.282 min，胆红素的色谱峰保留时间为13.380 min，胆红素与其他组分能达到基线分离，分离度大于1.5，理论塔板数按胆红素的峰计不低于2000,色谱图见图1～4。

图1 空白溶剂二甲基亚砜色谱图

图2 空白血浆色谱图

图3 胆红素标准品色谱图(色谱峰1、2、3为胆红素三个同分异构体)

图4 胆红素-血浆色谱图

2.5 线性关系的考察

2.5.1胆红素标准曲线 精密吸取胆红素标准溶液1.0 ml置于10 ml棕色容量瓶中，用二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液适量稀释，得到浓度分别为0.56、3.0、6.0、12.0、24.0 μg·ml-1胆红素系列标准溶液。按上述色谱条件进样20 μl，测定峰面积(A)，以A对浓度(C)作线性回归，得回归方程A=52681C-26798(r=0.9995)。胆红素标准品在0.56～24.0 μg·ml-1范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9995)。

2.5.2血浆中胆红素的线性关系 精密吸取胆红素贮备液加入空白血浆，分别得到浓度为17.5、35、70、140、280 μg·ml-1的胆红素血浆溶液。按上述色谱条件进样20 μl，测定峰面积A，以A对浓度(C)作线性回归，得回归方程A=73131C-999834(r=0.9965)。

2.5.3最低检出限、定量限 在标准曲线及线性关系实验中，将配制的系列不同浓度溶液进样，记录色谱图，当信噪比S/N为3∶1时，胆红素的检测浓度为0.56 μg·ml-1，相当于最低检出量为0.056 μg。当S/N为10∶1时，胆红素的检测浓度为1.4 μg·ml-1，相当于定量限为0.14 μg。

2.5.4精密度试验 精密吸取胆红素对照品溶液20 μl，重复进样6次，计算峰面积的RSD为1.5%，胆红素的RSD较小，表明方法精密度良好。

2.5.5回收率 取空白血浆照“2.2”项下预处理精密加入胆红素贮备液制成血浆中胆红素的浓度分别为17.5、70、280 μg·ml-1。各取20 μl进样，记录色谱图，计算含药血浆中胆红素与胆红素标准液胆红素的峰面积之比，两者之比即为回收率。由表1可知，回收率在80%～120%范围内，本次实验所测胆红素3个浓度的平均回收率分别为108.15%、114.73%、102.46%，表明该测定方法准确度较高。

表1 胆红素的回收率

3 讨 论

3.1 胆红素色谱峰形的考察

因胆红素标准品是胆红素三个同分异构体的混合物[6]，色谱峰很难形成单一的色谱峰，定量以三个峰积分的总面积和计算。

3.2 柱温的选择

虽然提高柱温有利于改善传质和提高分析速度，但由于胆红素对光和热不稳定，在空气中遇光、受热极易氧化[7-8]，所以在配制过程中应选用棕色容量瓶，并且应在避光环境中进行实验，所以在室温条件下进行分离分析。

3.3 吸收波长的选择

本次实验采用参考文献[9-10]中的波长455 nm进行定量测定，方法可行，分离度较高。

3.4 流动相的选择

3.4.1流动相的pH值对胆红素的保留值和峰形都有影响，碱性愈强，其峰形愈尖锐。但是，为了保护色谱柱，流动相的pH值应接近7.1。

3.4.2当选择甲醇-二氯甲烷(或者氯仿)-醋酸做流动相时，冲柱子的方式是先用甲醇冲20 min，再用甲醇-水(10∶90)冲至少20 min，最后用甲醇冲至少20 min。最终使色谱柱保持在甲醇环境中，以保护色谱柱。