白花蛇舌草与半枝莲配伍对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

王信林 宋 歌 王艳新 徐 刚 徐晓燕 王德才

(泰山医学院药学院，山东 泰安 271016)

乳腺癌是严重威胁女性健康与生命的恶性肿瘤之一，其死亡率为女性恶性肿瘤致死的首位。目前，综合治疗模式虽提高了乳腺癌患者的生存率，但仍有复发率高、毒副作用大等缺点。因此，寻找一种高效、毒副作用小的抗癌药物成为目前抗肿瘤的研究热点。

半枝莲和白花蛇舌草分别为唇形科植物半枝莲和茜草科植物白花蛇舌草的干燥带根全草，均具有活血化瘀，清热解毒以及抗癌等功效。两者符合“七情和合”理论和组合原则，常以药对的形式出现在各种经典方剂中，对肿瘤疗效确切。研究表明，白花蛇舌草醇提物对白血病细胞株 HL-60[1]和结肠腺癌细胞株LS180[2]等细胞增殖均有抑制作用。半枝莲提取物亦能诱导白血病K562细胞发生凋亡[3]。本课题通过MTT法和CCK法检测半枝莲与白花蛇舌草的醇提液是否对乳腺癌细胞的增殖具有抑制作用，探讨二者分别对乳腺癌细胞MCF-7的作用，并观察二者配伍对MCF-7增殖的影响，为白花蛇舌草与半枝莲开发和临床抗肿瘤治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

MCF-7细胞株 (生命科学学院王凤泽老师惠赠);白花蛇舌草(中药饮片，购自泰安市漱玉平民药店)；半枝莲(中药饮片，购自泰安市漱玉平民药店)；DMEM培养基(GIBCO公司产品)；CCK8试剂盒(江苏凯基生物科技有限公司);MTT(Sigma公司);二氧化碳恒温培养箱(Thermo Scientific Heracell VIOS)、倒置相差生物显微镜(XDS-1B)、酶标仪(瑞士Tecan)。

1.2 方法

1.2.1白花蛇舌草70%乙醇提取物的制备 准确称量粉碎后的白花蛇舌草100 g放入1000 ml圆底烧瓶中，加入600 ml 70%乙醇， 60 ℃回流提取3次，每次2 h，合并滤液。使用旋转蒸发仪将滤液浓缩至浸膏状，再将浸膏置于烘箱中60 ℃烘干至粉末。将粉末收集，置于冰箱中4 ℃保存备用。

1.2.2半枝莲70%乙醇提取物的制备 准确称量粉碎后的半枝莲100 g放入1000 ml圆底烧瓶中，加入600 ml 70%乙醇， 60 ℃回流提取3次，每次2 h，合并滤液。使用旋转蒸发仪将滤液浓缩至浸膏状，再将浸膏置于烘箱中60 ℃烘干至粉末。将粉末收集，置于冰箱中4 ℃保存备用。

1.2.3MTT法检测白花蛇舌草与半枝莲醇提物对MCF-7细胞增殖的影响 取对数生长期的MCF-7细胞用胰蛋白酶消化，以含10%胎牛血清的DMEM制备为5×104个/ml细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μl，细胞长至近单层后培养细胞，吸净上层培养基，进行分组：(1)空白对照组：MCF-7细胞用不含药的DMEM培养基正常培养，复孔5个；(2)药物处理组：MCF-7细胞用下列终浓度的含药培养基培养，每个药物组各浓度均复孔5个。白花蛇舌草醇提物溶液浓度分别为：50，100，200，400 μg/ml；半枝莲醇提物溶液浓度分别为：25，50，100，200 μg/ml。(3)在二氧化碳恒温培养箱中恒温培养24 h后吸净培养基，在培养细胞的每孔中加入100 μl MTT溶液，然后继续在恒温培养箱中孵育4 h后，弃上清液，每孔加入150 μl二甲基亚砜溶解细胞内结晶。用酶标仪在490 nm波长测定吸光度值。

1.2.4CCK法检测白花蛇舌草与半枝莲醇提物配伍对MCF-7细胞增殖的影响 取对数生长期的细胞用MCF-7细胞胰蛋白酶消化，以含10%胎牛血清的DMEM制备为5×104个/ml细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μl，细胞长至近单层后培养细胞，吸净上层培养基，进行分组：(1)空白对照组：MCF-7细胞用不含药的DMEM培养基继续正常培养，复孔5个；(2)药物处理组：MCF-7细胞用最终浓度为白花蛇舌草和半枝莲醇提物两者配伍处理：终浓度分别为25，50，100 μg/ml的含药培养基每孔100 μl继续培养，每个药物组5个复孔；(3)在二氧化碳恒温培养箱中恒温培养24 h后吸净培养基，在培养细胞的每孔中加入100 μl PBS缓冲液，再加入CCK试剂10 μl，继续在恒温培养箱中孵育1 h后，用酶标仪测定在450 nm波长下的吸光度值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 白花蛇舌草和半枝莲醇提物对MCF-7细胞增殖的影响

与空白对照组比较，白花蛇舌草和半枝莲醇提物各剂量组能不同程度的抑制MCF-7细胞的增殖，且呈现明显剂量-效应关系。见表1、2。

表1 白花蛇舌草醇提物对MCF-7细胞增殖的影响

注：与空白对照组比较，**P<0.01。

表2 半枝莲醇提物对MCF-7细胞增殖的影响

注：与空白对照组比较，**P<0.01。

2.2 白花蛇舌草醇提物与半枝莲醇提物配伍(1∶1配伍)对MCF-7细胞增殖的影响

与空白对照组比较，白花蛇舌草醇提物与半枝莲醇提物配伍组能不同程度的抑制MCF-7细胞的增殖，且呈现明显剂量-效应关系。见表3。

表3 白花蛇舌草醇提物与半枝莲醇提物配伍对MCF-7细胞增殖的影响

注：与空白对照组比较，**P<0.01。

3 讨 论

白花蛇舌草和半枝莲因其生理活性的多样性、复杂性和高效性而备受诸多学者的关注，特别是在抗肿瘤方面，疗效确切[4-8]。由本次实验结果亦可清晰地看出，与空白对照组比较，不同浓度的白花蛇舌草醇提物及半枝莲醇提物都能不同程度的抑制MCF-7细胞的增殖，且呈现明显剂量-效应关系，表明两种药物的醇提物具有一定的抗肿瘤活性，可能与其抑制肿瘤细胞增殖有关。同时，对白花蛇舌草醇提物及半枝莲醇提物进行1∶1配伍，结果显示较单独使用时对于MCF-7细胞增殖的抑制作用更明显，表明白花蛇舌草及半枝莲的配伍应用可能较单用作用增强，具体机制不明确。

中药配伍理论是中医理论的精华，两种或多种药物配伍应用，既可避免单向用药的副作用，同时还可提高方剂疗效并缩短病程产生系统优势，全面兼顾病情。中药复方药代动力学研究表明，药物配伍能明显影响药物成分的动力学参数，且与药物的疗效和毒性相关。中药进入人体进而发挥多成分、多靶点、多途径的作用，必会引起整个生命网络中分子、细胞、器官、整体多个层面结构与功能状态的变化，而这些变化必然会体现在相关代谢物在量上的改变。根据中医理论和中药的作用过程，推测白花蛇舌草-半枝莲配伍作用过程可能发生在下列环节：(1)药剂学环节，配伍前后活性成分的变化；(2)药动学环节，机体对配伍前后活性成分的吸收、代谢过程变化；(3)药效学环节，配伍前后对药效的增强作用。因此，要阐明白花蛇舌草-半枝莲配伍的作用机制，就要针对上述3个环节进行整体研究，整体阐明白花蛇舌草-半枝莲配伍的物质基础和作用机理。因此，今后在对白花蛇舌草-半枝莲药对的研究中，从配伍前后活性成分吸收、代谢等环节，阐明白花蛇舌草-半枝莲配伍的可能机理，并为白花蛇舌草和半枝莲配伍应用于临床提供科学依据。