L型钙离子通道的生物学特性及其在听觉功能中的作用*

祁繁 陈金 褚汉启

电压门控性钙离子通道(voltage-gatedcalciumchannel,VGCC)是钙内流的主要途径，依据电生理和药理学特性可以分为L、N、P/Q、R和T五型，能被二氢吡啶类(dihydropyridines,DHPs)拮抗的VGCC通道属于L-型钙离子通道(L-type Ca2+channels,LTCCs)。作为钙离子通道中的重要一员，LTCCs广泛存在于各种兴奋细胞及许多非兴奋细胞中,介导的细胞功能包括兴奋-收缩耦联、信号转导、神经递质的释放等，在听觉系统的发育、内耳钙离子稳态以及听觉功能的正常发挥中起重要作用。本文对L型钙离子通道的生物学特性及其在听觉功能中的作用进行综述。

1 LTCCs的分子结构

LTCCs是由α1、α2、δ、β、γ五个亚单位构成的高分子跨膜蛋白复合体，并且有多个编码基因。α1亚单位是钙离子通道的主要功能亚基，包含有感受膜电位变化的电压感受器、决定通透离子种类的选择性滤器和各种已知的被第二信使、药物和毒素作用的结合位点等。α2、δ、β、γ为辅助亚基。目前已证明α1亚单位有4个亚型，即α1S(CaV1.1)、α1C(CaV1.2)、α1D(CaV1.3)、α1F(CaV1.4)[1]。α1由4个同源性跨膜结构域(序列Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)组成，其N末端与C末端均在胞浆内，每个结构域中含有6个跨膜α螺旋肽段(S1～S6)及其间的连接肽链, S1～S3和S5～S6肽段为高度疏水性的螺旋片段，S4肽段为亲水性，含有排列规则、带正电荷的赖氨酸和精氨酸残基，具有电压感受器的作用，膜电位的变化可以引起氨基酸残基相应位置的改变，继而引起孔道构象发生相应变化，导致通道开放或关闭。S5～S6间肽链有一部分折入膜内，形成电压门控离子选择性滤孔，称为孔道区(P区)，该区表现为强烈保守性，是通道的核心部分，起电压感受器作用[2]。

α2和δ亚单位分子量约170 kD，是由一个基因(7q21-q22)编码的,转录翻译后因蛋白水解而裂解成α2和δ两个片段。δ亚单位与α1相连，通过二硫键将α2蛋白锚定在胞膜上。β亚单位是一种位于细胞膜内侧的非糖多肽,存在多个磷酸化位点可被多种蛋白激酶磷酸化。β亚单位也由多基因编码,分子量约55～72 kD,至今已发现有四种β亚单位异构体β1、β2、β3、β4，每个亚型有多个剪接变异体，他们位于细胞膜的内侧，都是疏水、非糖基化的蛋白。β亚单位主要是与α1亚单位的AID结构连接，在α1亚基装配及表达中起着重要的作用。β亚基还存在多处蛋白激酶的磷酸化位点，参与通道磷酸化过程的调节，可加速钙离子通道激活及改变其药理性质。γ亚单位之前被认为是由单一基因编码的整合膜蛋白,且只存在于骨骼肌中，目前已发现有8种编码基因γ1～γ8，存在4个跨膜结构，位于细胞内的N端和C末端，2个潜在的胞外N-糖基化位点。

2 LTCCs的组织表达及生理功能

LTCCs分布广泛，主要表达于各种可兴奋细胞，如骨骼肌、心肌、神经元细胞等。不仅参与骨骼肌、心肌、平滑肌的兴奋-收缩耦联，而且介导调控内分泌细胞和神经细胞释放激素及神经递质，并与基因表达有关[3]。LTCCs四种亚型的分布具有组织特异性[4]。

CaV1.1钙离子通道是最早被鉴定出的电压门控性钙离子通道，主要在骨骼肌中表达[5]，是肌肉兴奋-收缩耦联过程中的关键蛋白。骨骼肌细胞在兴奋性信号作用下会导致膜电位的变化，CaV1.1钙离子通道在感受膜电位变化后与肌质网膜上的RyR1蛋白发生相互作用，导致RyR1将肌质网中的钙离子快速大量释放到肌细胞质中，进而引起骨骼肌收缩。编码CaV1.1钙离子通道的基因突变可引起低钾性周期性麻痹、恶性高热、先天性肌病。CaV1.1钙离子通道的α1亚基负责运输钙离子，其他亚基不参与钙离子运输，但对通道的电压感受、电生理特征以及细胞定位等有重要的调控作用。最近的研究揭示了真核生物电压门控钙离子通道复合物CaV1.1钙离子通道的三维结构，他们探索了新的蛋白提纯方法，最终获得了性质良好的蛋白样品，利用单颗粒冷冻电镜方法，重构出了分辨率为4.2埃的兔源CaV1.1钙离子通道蛋白复合物冷冻电镜结构，首次展示了CaV1.1钙离子通道蛋白各个亚基的相互作用面和亚基内部结构域的分布情况，揭示了各个辅助亚基(α2、δ、β、γ)调控离子通道亚基(α1)的分子机理，为理解其功能及与疾病的相关机制提供了重要的结构基础[6]。

CaV1.2钙离子通道主要分布于心血管系统中[7]。细胞膜去极化后，钙离子通过CaV1.2钙离子通道快速内流继而引发一系列的生理过程，如平滑肌兴奋-收缩耦联，神经递质分泌释放和基因表达等[3]。在心肌细胞中，CaV1.2钙离子通道介导的钙离子内流触发肌浆网钙释放通道ryanodine受体(RYR)开放，肌浆网储存的钙离子大量释放，这种级联效应称为“钙离子诱导的钙离子释放”(Ca-induced Ca2+release,CICR),在心肌的兴奋-收缩耦联中起着关键性作用[8]。CaV1.2钙离子通道在动脉血管平滑肌收缩功能方面也起着非常重要的作用，在生理条件下，CaV1.2钙离子通道通过兴奋-收缩耦联机制引起细胞收缩，条件性敲除平滑肌CaV1.2α1C亚基的小鼠(smooth muscle α1C-subunit calcium channel knockout,SMACKO)不仅显现出膀胱功能异常和蠕动功能缺失，而且还出现平滑肌功能障碍和血压调节紊乱。既往研究发现，在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)的血管平滑肌细胞膜上，CaV1.2钙离子通道表达量明显升高，从而导致细胞钙离子内流增加，血管顺应性降低[9]。

CaV1.3钙离子通道主要分布于中枢神经系统，基因定位在3P14.3,其代表着神经内分泌特异的L型钙通道,参与钙稳态、激素分泌、基因表达和突触可塑性等多种功能的调控，并在神经元的存活和死亡中有重要作用。最近研究表明，CaV1.3钙离子通道参与调控背侧海马新生神经元形成以及海马依赖性学习和记忆功能[10]。Wang等[11]在对帕金森综合征发病机制的研究中发现， 经1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)处理过的小鼠，CaV1.2钙离子通道和CaV1.3钙离子通道均上调，提示L型钙离子通道的上调可能直接导致多巴胺神经元的离子内流增加，从而导致多巴胺神经的退化。除了神经内分泌系统，CaV1.3钙离子通道在内耳和心肌组织中也有表达。CaV1.3钙离子通道是内耳主要的钙通道，控制耳蜗内毛细胞钙离子内流和内耳传入神经突触的递质释放，与听觉信号的产生密切相关。前期的研究发现，CaVl.3钙离子通道在内耳中主要表达于耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞、螺旋韧带、血管纹边缘细胞等[12，13]。在编码CaV1.3钙离子通道的基因敲除小鼠，其显著的表型不仅有听力缺失,而且有明显的窦性心动过缓和房室传导阻滞[14]。近年来分别在大鼠、小鼠和人的心肌组织中证实了CaV1.3钙离子通道RNA的存在，但集中表达于传导组织(窦房结、房室结)及心房[15]。与CaV1.2钙离子通道相比，CaV1.3钙离子通道被激活的膜电位更偏向于超极化方向(约有10 mV的偏移)。这种特性允许CaV1.3钙离子通道参与心肌起搏组织的舒张期去极化。Toyoda等[16]的研究也证实，CaV1.3钙离子通道在构成窦房结DHP敏感型钠离子电流中占有重要地位。

CaV1.4钙离子通道最先被报道特异性表达于视网膜[17]。CaV1.4钙离子通道在视网膜感光细胞和双极细胞突触传递过程中至关重要，众多研究发现在X连锁缺陷的先天性静止性夜盲患者身上存在编码CaV1.4钙离子通道的基因突变，而敲除了编码CaV1.4钙离子通道基因的小鼠也表现出2型先天性静止性夜盲和3型X连锁锥杆营养不良。最近Doering等[18]利用美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库进行了表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)分析，发现除了视网膜外，CaV1.4钙离子通道蛋白的mRNA还表达于很多其他组织中，如眼睛、心脏、骨骼肌、胸腺、颅神经、淋巴细胞、内分泌组织等，这些研究发现表明CaV1.4钙离子通道不仅在光感受细胞中扮演了重要的角色，还可能在机体其他部位发挥重要的生理功能。

3 L型钙离子通道在听觉功能中的作用

听觉系统分为外周和中枢两部分，外耳、中耳、内耳和蜗神经为外周听觉系统，听神经以上的所有听觉结构为中枢听觉系统，耳蜗核、上橄榄核、下丘、内侧膝状体和听皮层是主要的上行听觉通路。听觉信号的转导涉及耳蜗内离子浓度和蜗内电势自稳态的维持、内外毛细胞电兴奋的维持、机械-电能转换、信号识别、调制和转导、听觉信息的初步编码和向中枢的传递等，L型钙离子通道在正常听觉生理中具有重要作用[19]。研究表明在听觉通路中发挥作用的L型钙离子通道主要是CaV1.2钙离子通道和CaV1.3钙离子通道，对耳蜗的发育、内淋巴电位(EP)的产生和调节、内耳钙离子稳态以及听觉功能的正常发挥至关重要，而CaV1.1钙离子通道和CaV1.4钙离子通道在听觉系统中无明显表达，其作用尚不明确[20]。

3.1L型钙通道在外周听觉系统中的功能 在外周听觉系统中，CaV1.2钙离子通道主要表达于外毛细胞、螺旋神经元和脑干橄榄耳蜗传出神经突触，其在周围听觉系统听觉信号的调控中也扮演了至关重要的角色。CaV1.3钙离子通道敲除的小鼠耳蜗毛细胞钙流减少90%,提示内毛细胞上可能还表达其他类型的钙通道，如CaV1.2钙离子通道,这与电生理学的研究一致[21]。Lv等[22]研究发现在耳蜗螺旋神经元有CaV1.2钙离子通道表达，他们进一步运用shRNA基因敲降技术特异性降低耳蜗螺旋神经元CaV1.2钙离子通道的表达，证实CaV1.2钙离子通道的表达对螺旋神经节细胞的生存很重要。选择性敲除螺旋神经元上的CaV1.2钙离子通道可以降低噪声性聋的易感性[23]，这可能与CaV1.2钙离子通道通过对脑源性神经营养因子( brain derived neurotrophic factor ，BDNF)的转录调控参与调节突触功能有关。此外Liang等[24]发现在耳蜗I型螺旋韧带成纤维细胞中也有CaV1.2钙离子通道表达，通过对胞内钙离子浓度的调控影响钙离子依赖性钾通道的活性。由于CaV1.2钙离子通道敲除对新生小鼠有致死性的危害，故其在听觉通路中发挥的确切作用尚未证实。

CaV1.3钙离子通道主要分布于耳蜗内外毛细胞、螺旋神经节、螺旋韧带、血管纹[13]。毛细胞中的L型钙通道主要是CaV1.3钙离子通道，位于突触前膜，控制内毛细胞钙离子内流和内耳传入突触的递质释放，其与听觉信号的产生密切相关。CaV1.3钙离子通道基因敲除小鼠毛细胞的突触、突触后以及螺旋神经节均出现中到重度的损伤,以致外周以及中枢听觉功能不同程度的损伤[25],并最终导致毛细胞退变、小鼠表现出耳聋。血管纹上CaV1.3钙离子通道对于内淋巴电位(EP)的形成和维持也不可或缺。Chen等[26，27]进一步研究发现CaV1.3钙离子通道蛋白的表达有一定的组织特异性和年龄相关性，无论是转录水平还是翻译水平，CaV1.3钙离子通道均随着鼠龄的增长而逐渐减弱，年龄相关性听力下降可能与CaV1.3离子通道蛋白表达下调有关。此外研究还发现外毛细胞底侧膜上的L型钙离子通道开放引发钙离子内流，可能参与毛细胞的机械-电-机械换能和耳蜗调谐的过程[28]。

3.2L型钙通道在听觉中枢中的功能 近些年来随着研究的逐渐深入，有越来越多的证据提示L型钙离子通道除了在耳蜗中发挥了必不可少的作用外，还参与了中枢听觉通路的结构和功能。触觉小体终端的听觉神经纤维末梢与前腹侧耳蜗神经核的毛细胞相连，研究发现触觉小体终端有超过6 000个电压门控性钙离子通道的表达，在动作电位期间有一半处于开放状态[29]。 Koyano等[30]进一步研究发现L型钙通道可能参与了鸟类前庭神经外侧核的耳蜗神经编码瞬时声音信息的过程。负责调节电压门控性钙通道的表达和功能的α2δ3mRNA，主要在螺旋神经元和听性脑干神经中表达，其编码的蛋白在听性反应中发挥了重要作用，Pirone等[31]据此在α2δ3(-/-)小鼠中发现突触前膜钙离子通道减少，且与耳蜗神经核细胞相连的听觉神经纤维也变小，进一步提示钙离子通道可能参与了听觉传导通路对声音的处理过程。Liu等[32]也发现，水杨酸可以降低听皮层锥体神经元的钠离子、钾离子和钙离子流，这表明水杨酸可以通过影响听皮层离子通道，一方面提高神经元的兴奋性，另一方面增加兴奋性神经递质的释放，减少抑制性神经递质的释放，从而导致耳鸣。

CaV1.2钙离子通道不仅在耳蜗中参与了听觉的产生，在中枢听觉信号的传导中也至关重要。在新生小鼠皮层中，CaV1.2的表达量很低，随着年龄增长而呈现增加的趋势，在生后第8天达到高峰，第21天开始下降，特异性敲除胎鼠听性脑干的CaV1.2钙离子通道后，听性核团的体积和数量显著减少，这表明CaV1.2钙离子通道在中枢听觉通路的发育过程中发挥作用，但与CaV1.3钙离子通道敲除模型相比，外侧上橄榄核的激活和神经递质的传递功能似乎并未受到影响[33]。谢鼎华等[34]发现庆大霉素通过抑制内侧橄榄耳蜗传出神经而改变耳蜗机械特性和听觉传入活动，推测可能与阻滞外毛细胞钙离子通道有关；王枫等[35]研究进一步证实庆大霉素耳毒性使CaV1.2钙离子通道表达显著减少，影响钙离子运行及听觉产生。

CaV1.3钙离子通道在中枢的发育过程中扮演了关键的角色，尤其是对听觉中枢系统的正常发育至关重要。和CaV1.2 钙离子通道敲除鼠一样，CaV1.3钙离子通道缺失的小鼠除了表现出耳聋外，其听性脑干尤其是外上侧橄榄核的结构也发生了相关性改变[36]，说明CaV1.3钙离子通道和CaV1.2钙离子通道不仅参与了耳蜗钙离子流和递质释放，对听觉中枢的结构和功能正常发育也至关重要。此外研究还发现敲除CaV1.3钙离子通道后，低阈值钾通道阻断剂敏感性电流 (α-dendrotoxin-sensitive LTK currents ,IDTX)减少，影响了突触信号的传导，从而导致听觉中枢功能异常[37]。

4 问题与展望

综上所述，L型钙离子通道在听觉中枢、传导通路以及内耳中的表达水平可能与听觉系统的发育以及听觉功能的形成密切相关。虽然前期的研究取得了一定进展，但对于L型钙离子通道在听觉系统中的各个区域的定位以及在内耳生理作用机制中的确切功能还有待更深入的研究，例如：听觉传导通路中的钙离子转运；内耳钙离子转运及循环；内耳钙离子通道的差异性表达与钙离子稳态间的联系；LTCCs缺失导致耳聋的发生机制等等都需要进一步的研究阐明，这些都将为后期的药物及基因治疗耳聋提供理论依据。