S100B蛋白在C57/BL6J小鼠螺旋神经节细胞内的表达*

高险亭 卢岭 张莹莹 梁耕田 杨丽萍

S100B蛋白是神经组织蛋白中的一种不含糖、脂和磷的酸性钙结合蛋白，主要分布在中枢神经和周围神经系统的神经胶质细胞、施旺细胞以及某些神经元中[1]。研究发现，S100B蛋白在脑血管疾病、颅脑损伤、中枢神经系统炎症、阿尔茨海默症、精神分裂症等患者体内血清中表达升高，并与神经症状的严重程度呈正比[2]。老年性聋的发病机理还不清楚，听神经退化原因尚未明确，有文献报导幼、老年小鼠耳蜗内S100B蛋白表达有差异[3]，S100B蛋白表达是否与螺旋神经节细胞老化有关，值得研究。本实验拟通过组织学方法，检测2月龄和12月龄C57BL/6J小鼠螺旋神经节细胞(SGC)中S100B蛋白表达，探讨S100B蛋白在老年性聋发病中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 取SPF级C57BL/6J小鼠40只，雌雄各半。2月龄组20只，体重 l0～15 g； 12月龄组20只，体重25～40 g。所有动物正常饮食，排除中耳及内耳疾病，行听性脑干反应(ABR)检测后进行实验。

1.2ABR阈值检测 控制室温20±2 ℃，动物用10%水合氯醛(330 mg/kg)腹腔注射麻醉后，采用Nicolet Compass系统的专用电阻检测仪，安插针式电极，记录电极刺入前颅顶正中穿透皮肤至颅骨骨膜，置于冠状缝中点处，给声耳及对侧耳后皮下分别刺入参考电极和接地电极。TDH-39型耳机给声，声源距耳廓1 cm，诱发电位用信号处理机叠加处理，刺激声为交替短声，重复率10次/秒。带通滤波为32～3 000 Hz，扫描时间10 ms，叠加512次；以引出可重复出现ABR波Ⅱ的最小刺激声强度作为其反应阈。

1.3血清标本采集和处理 两组各取10只小鼠内眦静脉取血，每次采血量0.8 ml左右，3 000转/分钟离心10分钟，取上清液，多次离心直至澄清，-20 ℃保存。严格按照小鼠血清S100B蛋白酶联免疫试剂盒说明书的要求检测各种浓度的标准品的吸光度，并绘制标准曲线、求得回归方程。采用ELISA法检测血清S100B蛋白的吸光度，根据回归方程和吸光度求得S100B蛋白浓度。

1.4石蜡切片制作 两组各取小鼠10只快速引颈脱臼断头处死，迅速取出双侧颞骨，打开听泡，暴露耳蜗，并在蜗尖钻孔，于4%多聚甲醛溶液(pH 7.4)4 ℃冰箱内固定20 h，PBS(pH 7.4)冲洗，10%EDTA(pH 7.4)X轴纵向切片(厚度4 μm)，烤干后行HE染色，光镜下观察螺旋神经节细胞并计数。

1.5免疫组化染色检测S100B蛋白表达 每张切片经常规二甲苯脱蜡、梯度酒精至水化后，蒸馏水冲洗，用3%过氧化氢室温孵育切片10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。将适量的枸橼酸(pH=6.4)抗原修复液注入烧杯内置于水浴锅中加热至90 ℃，15 min后室温冷却，PBS冲洗3 min。对经过上述过程处理后的切片标本，分别滴加浓度为1∶200兔抗鼠S100B多克隆抗体(abcom)，37 ℃孵育 2小时，4 ℃过夜；用PBS缓冲液洗2 min×3次，滴加非生物素标记山羊抗兔IgG辅助剂，室温孵育15 min；PBS缓冲液洗2 min×3次，非生物素标记山羊抗兔IgG，室温孵育15 min；PBS缓冲液洗2 min×3次；DAB镜下控制显色，水洗，复染，脱水，中性树胶封片，用PBS缓冲液代替一抗作为标本染色的阴性对照。

结果判断：阳性染色为胞膜、胞浆及胞核中出现棕黄或者棕黑色颗粒。每张免疫组化切片取2个400倍视野，选取底回中着色的螺旋神经节细胞所占的区域作为阳性表达面积，采用Image-Pro Plus6.0图像分析仪测其阳性染色面积和平均光密度值(IOD)，每次结果计算三次求均值。

表1 两组小鼠ABR反应阈、血清S100B含量、SGC计数及其蛋白表达比较

注：*与2月龄小鼠比较，P<0.05

2 结果

2.1两组ABR阈值 两组小鼠ABR阈值见表1，可见12月龄组小鼠ABR阈值明显高于2月龄小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)，符合老年性聋。

2.2两组血清S100B含量 两组小鼠血清S100B含量见表1，可见12月龄小鼠血清中的S100B含量比2月龄高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3两组螺旋神经节细胞HE染色结果 200倍镜下观察2、12月龄C57/BL6J小鼠耳蜗HE染色整体观，SGC位于耳蜗内，图1a示2月龄组毛细胞排列整齐，血管纹清晰，图1b示12月龄组毛细胞部分缺失，血管纹萎缩；800倍镜下见2月龄组小鼠螺旋神经节细胞较密集，形态完整，胞核大(图1c)；12月龄小鼠SGC分布松散，胞核浓缩变小，呈萎缩性改变(图1d)。经IPP13计数，12月龄小鼠中SGC数量较2月龄组明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 两组螺旋神经节细胞镜下HE染色图片 a、b分别示200倍镜下观察,2(a)、12(b)月龄组C57/6J小鼠耳蜗HE染色整体观;c、d分别示800倍镜下SGC染色,12月龄(d)小鼠SGC较2月龄组(c)明显减少

2.4两组S100B蛋白表达结果 S100B在小鼠耳蜗的螺旋神经节细胞内有表达，主要分布在细胞膜、细胞浆和细胞核中，2月龄组螺旋神经节细胞中见部分胞膜和胞浆染色(图2a)，12月龄组胞核中见大量表达(图2b)。由表1可见S100B在12月龄小鼠螺旋神经节细胞中的阳性表达面积较2月龄组大，平均光密度值也比2月龄小鼠大，组间差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

老年性聋是伴随机体衰老而出现的以高频听力下降为主的双侧对称性感音神经性聋，其发病机理还不清楚，病理特点多以毛细胞缺失或螺旋神经节细胞退化为主[4]。C57BL/6J小鼠是研究较成熟的一种老化性动物模型[5]，文中结果显示，12月龄C57BL/6J小鼠ABR反应阈较2月龄小鼠高，且12

图2 两组小鼠螺旋神经节细胞S100B蛋白免疫组化染色图片(×400) 2月龄SGC中部分胞膜和胞浆染色(a),12月龄组胞核中见大量表达(b)

月龄小鼠耳蜗内毛细胞部分缺失，血管纹萎缩，SGC计数减少；镜下观察，2月龄小鼠SGC胞浆小核大，分布密集，12月SGC胞大核小，核浓缩，某些呈空泡样改变，是神经细胞衰退的细胞学变化，与人类老年性耳蜗形态学改变一致。

近年来研究发现血清或脑脊液中S100B水平与神经系统疾病具有相关性[6]，脑损伤后血液中升高的S100B可作为中枢神经系统损伤的监测指标之一；也有学者将S100B蛋白描述为脑的“C反应蛋白”[7]。S100B蛋白作为钙结合蛋白后来被发现为损伤相关模式分子(damage associated molecular patterns,DAMP)，DAMP被认为是一系列与细胞死亡和组织损伤有关的细胞内分子，可以作为内源性危险信号来激活炎症反应[8]，生理浓度下它可推动神经元发育和损失修复，而高浓度的S100B对神经系统具有毒性作用[9]。在各种原因致神经元损失过程中，反应性的星型胶质细胞增殖和活化，导致大量S100B生成，可通过引起钙超载、升高一氧化氮浓度促使神经纤维缠结等途径诱导细胞凋亡[10]。本实验发现12月龄小鼠血清中S100B含量高于2月龄小鼠，结合两组小鼠SGC形态学观察，推测血清S100B含量低于0.2 μl/g可能为生理需要量，促进螺旋神经元发育和修复，而相对高浓度0.80 μl/g可能通过某种信号传导促进钙超载，激活炎症反应诱导螺旋神经细胞凋亡坏死，具体机制有待进一步研究。

C57BL/6J小鼠随月龄增加螺旋神经节细胞不同程度凋亡或坏死，符合人类衰老的进程，本实验结果示12月龄鼠血清中S100B含量偏高，免疫组化示S100B蛋白在两组小鼠耳蜗SGC均有表达，但分布部位和密度不同，2月龄组主要表达于胞膜和胞浆，12月龄组的胞核见大量表达，且S100B阳性表达面积较2月龄组大，表明老年鼠耳蜗SGC中S100B表达增多。细胞核是细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，推测S100B参与细胞抑制周期相关进程；既往研究表明[11]在正常人体内晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end-products,RAGE)随着年龄增加不断积累，说明RAGE与衰老之间有密切关系，并在一定度上影响了细胞凋亡的发生。已有研究证明随年龄增大RAGE在SGC中的表达增多且参与老年性聋的发病过程[12]；此外，S100B激活神经细胞中的Ras-MEK-ERK1 / 2-NF-κB通路，并导致GTP酶、Rac1/Cdc42和神经突生长的激活[13]；S100B作为RAGE的配体之一[14]，是否为两者的结合激发相关信号分子以促进衰老的进程，值得进一步探讨。