miR-23b通过MAPK信号通路对H2O2诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用

陈德才 王雅 马从乾 杨轲 陈辉 陈德霞

(郑州大学附属南阳市中心医院 1血管外科，河南 南阳 473200；2肾内科；3南阳市方城县人民医院血液净化科)

高血压、冠心病等多种心血管疾病的发生和发展与血管内皮细胞受损密切有关，血管内皮损伤导致血栓的形成是多种心血管疾病的病理基础〔1〕。氧化应激、氧化低密度脂蛋白、肾素-血管紧张素系统、同型半胱氨酸等多种因素都可以影响血管内皮细胞损伤〔2〕。氧化应激通过促进炎症细胞的生长，促进内皮细胞凋亡，促进炎症因子过表达，降解细胞外基质等方式损伤血管内皮细胞〔3〕。氧化应激造成的血管内皮细胞损伤是由活性氧(ROS)介导的，ROS可以调节胞质内钙离子浓度及一氧化氮(NO)的生成，减弱血管舒张，导致血管内皮受损〔4〕。microRNA(miR)非编码RNA可调控多种信号通路，参与细胞增殖、分化、凋亡及黏附等过程，并参与肿瘤的发生和发展〔5,6〕。目前研究显示，miR可调控血管内皮细胞增殖、凋亡、分化及血管形成等生理病理过程。miR-23b可通过调控核因子(NF)-κB信号通路，调节相关炎症因子和细胞因子的表达起到自身免疫作用〔7〕。最近研究发现，通过生物信息学的手段对miR-23b相关靶基因通路进行分析发现，miR-23b可调控Notch信号通路、Wnt/c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路等，对其作用的靶基因的功能进行分类，主要包括调控细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、参与免疫调节、促进血管形成、介导炎症反应等功能〔8～10〕。本研究探讨miR-23b对血管内皮细胞损伤保护作用与MAPK信号通路的相关性。

1 材料与方法

1.1材料 人血管内皮细胞(HUVECs)株购自美国ATCC公司，试剂：胰蛋白酶、DMEM培养基、胎牛血清购自美国Sigma公司；Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；miR-23b mimic及miR-23b-mimic阴性对照购自上海GnenPharma公司；白细胞介素(IL)-1β(PeproTech，美国)；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自美国Promega公司；SYBR Green Gene Expression Assay购自大连Takara公司；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自南京森贝伽生物公司；丙二醛(MDA)试剂盒、过氧化物歧化酶(SOD)试剂盒及乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒均购自北京博奥森生物公司；实验所用引物均由上海生工合成；p38-MAPK抗体、p-p38抗体、Bax抗体、酶切(Cleaved)Caspase-3抗体、辣根过氧化物标记的二抗均购自美国Abcam公司。

1.2血管内皮细胞的培养和分组 血管内皮细胞接种于杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)中，于37℃、含5%CO2培养箱中培养，以0.25%的胰蛋白酶进行消化传代，取生长良好的细胞用于实验。实验分为四组，空白(Blank)组：不做任何处理正常培养的血管内皮细胞；H2O2组：在细胞培养液中加入H2O2，调整其终浓度为0.1 mmol/L，建立血管内皮细胞氧化应激损伤模型；miR-23b-mimic+H2O2组：血管内皮细胞转染miR-23b mimic后加入终浓度为0.1 mmol/L H2O2处理；mimic-nc+H2O2组：血管内皮细胞转染miR-23b mimic阴性对照后加入终浓度为0.1 mmol/L H2O2处理。转染具体步骤按照Lipofectamine2000转染试剂说明书进行操作。处理后置于7℃、5%CO2培养箱中继续培养。

1.3qRT-PCR检测HUVECs miR-23b表达 各组细胞分别培养24 h以后，分别收集细胞，按照每10 cm2的细胞加入1 ml的Trizol，裂解各组血管内皮细胞，再加入1/5体积的氯仿溶液，混匀后剧烈震荡15 s，4℃下12 000 r/min离心10 min。取上清液至另一新的EP管，用预冷的异丙醇沉淀RNA，用75%的乙醇洗涤RNA，最后用RNase-free ddH2O溶解RNA。经纯度和浓度检测后，用M-MLV逆转录试剂盒合成cDNA，用SYBR Green Gene Expression Assay进行荧光定量PCR扩增，采用20 μl反应体系(cDNA 2 μl、正义链0.5 μl、反义链0.5 μl、2× SYBR Green qPCR Master Mix 10 μl、ddH2O 7 μl)。以β-actin为参照，用相对定量2-△△CT计算miR-23b相对表达量。引物：GAPDH-正义5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，反义5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′；miR-23b-正义5′-TGGGTTCCTGGCATGC-3′，反义5′-TCGTATCCAGTGCAGGGTC-3′。

1.4流式细胞术检测HUVECs凋亡情况 各组血管内皮细胞以上述方法处理后培养24 h，用胰蛋白酶进行消化，收集细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)将各组细胞洗涤2次后，加入约400 μl的结合缓冲液混匀，吹打制成单细胞悬液，再依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，轻柔混匀后置于室温中避光孵育15 min，用流式细胞仪测定凋亡情况。

1.5Western印迹检测细胞中p38-MAPK、p-p38、Cleaved Caspase-3、Bax水平 各组HUVECs分别培养24 h以后，每孔细胞中加入适量苯甲基磺酞氟(PMSF)裂解液，置冰上孵育约20 min。用细胞刮将细胞刮落，收集到离心管中，4℃下12 000 r/min离心10 min。采用二喹啉甲酸(BAC)法对蛋白进行定量。每个泳道加入40 μg蛋白样品进行电泳，采用5%的浓缩胶和10%的分离胶，浓缩胶的电流为20 mA，分离胶的电流为40 mA，当指示剂电泳至凝胶底部时停止。采用半干法进行转膜，在4℃条件下以80 V电压转膜90 min。将硝酸纤维素膜放入5%牛血清白蛋白中，室温下在摇床上封闭60 min。分别加入p38-MAPK(1∶800稀释)、p-p38(1∶800稀释)、Cleaved Caspase-3(1∶1 000稀释)、Bax(1∶500稀释)一抗4℃过夜孵育，再加入1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，在室温下孵育2 h。采用电化学发光(ECL)试剂盒进行显影，用成像系统进行扫描，用软件分析各组细胞中p38-MAPK、p-p38、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平。

1.6检测血管内皮细胞中过氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)活性 上述方法处理细胞后24 h，收集细胞，1 000 r/min离心10 min，去掉上清培养液，用PBS洗涤3次，用PBS重悬各组细胞，通过超声波细胞破碎仪冰浴中破碎5 s×5次，使细胞破碎，黄嘌呤氧化酶法检测血管内皮细胞中SOD活性，硫代巴比妥酸法检测血管内皮细胞中MDA含量，比色法检测血管内皮细胞中LDH活性。

1.7MAPK信号通路激活剂上调miR-23b的表达对H2O2诱导的HUVECs的影响 在转染后H2O2诱导处理HUVECs 24 h后，加入10 μmol/L的MAPK激活剂茴香霉素处理记为Anisomycin组。用流式细胞术测定48 h HUVECs凋亡情况，步骤同1.4。蛋白质印迹法测定48 h细胞中p38-MAPK、p-p38、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平，步骤同1.5。检测48 h血管内皮细胞中SOD、MDA、LDH活性，步骤同1.6。

1.8统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1qRT-PCR检测HUVECs miR-23b表达 H2O2组HUVECs miR-23b水平(0.64±0.07)明显低于Blank组(1.00±0.00)(P<0.05)，miR-23b-mimic+H2O2组miR-23b水平(3.21±0.28)明显高于mimic-nc+H2O2组(0.62±0.06)(P<0.05)，mimic-nc+H2O2组细胞内miR-23b水平与H2O2组无明显变化(P>0.05)；4组差异有统计学意义(F=212.560,P=0.000)。

2.2miR-23b上调减少H2O2诱导的血管内皮细胞凋亡 与Blank组相比，H2O2组血管内皮细胞凋亡率明显升高，细胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平显著上调(P<0.05)。与H2O2组相比，miR-23b mimic+H2O2组细胞凋亡率和细胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平明显降低(P<0.05)，H2O2组与mimic-nc+H2O2组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。提示H2O2诱导血管内皮细胞凋亡，而上调miR-23b可减少H2O2诱导的血管内皮细胞凋亡，减少细胞中Caspase-3活化，减少Bax表达。见图1和表1。

2.3miR-23b上调减少H2O2诱导的血管内皮细胞氧化损伤 与Blank组相比，H2O2组血管内皮细胞中SOD活性显著降低，MDA含量和LDH活性显著升高(P<0.05)；与mimic-nc+H2O2组相比，miR-23b mimic+H2O2组血管内皮细胞中SOD活性显著升高，MDA含量和LDH活性显著降低(P<0.05)；mimic-nc+H2O2组与H2O2组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。说明H2O2诱导血管内皮细胞发生氧化损伤，上调miR-23b可以缓解H2O2诱导的血管内皮细胞的损伤。见表1。

2.4MAPK信号通路激活剂对血管内皮细胞中p38-MAPK、p-p38的影响 与H2O2组相比，miR-23b mimic+H2O2组细胞中p38-MAPK和p-p38的表达水平明显降低(P<0.05)。与miR-23b mimic+H2O2组相比，Anisomycin组细胞中p38-MAPK和p-p38的表达水平明显升高(P<0.05)。说明上调miR-23b可以抑制p38-MAPK和p-p38表达，抑制MAPK信号通路激活，加入MAPK信号通路激活剂后可以上调p38-MAPK和p-p38表达，激活MAPK信号通路。见图2，表2。

图1 miR-23b对H2O2诱导的血管内皮细胞凋亡及对细胞中Cleaved Caspase-3、Bax表达的影响

表1 各组血管内皮细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平及SOD、MDA和LDH活性比较

1)与Blank组比；2)与mimic-nc+H2O2组比:均P<0.05

2.5MAPK信号通路激活剂对血管内皮细胞损伤的影响 与H2O2组相比，miR-23b mimic+H2O2组细胞中SOD活性显著升高，MDA含量和LDH活性显著降低(P<0.05)。与miR-23b mimic+H2O2组相比，Anisomycin组细胞中SOD活性显著降低，MDA含量和LDH活性显著升高(P<0.05)。上调miR-23b可以降低H2O2诱导的血管内皮细胞损伤，而MAPK激活剂可以增加上调miR-23b降低的血管内皮细胞的损伤。见表2。

图2 Western印迹检测各组血管内皮细胞中p38-MAPK和p-p38的表达水平

表2 各组血管内皮细胞中p38-MAPK、p-p38表达及SOD、MDA和LDH活性比较

与H2O2组比：1)P<0.05；与miR-23b mimic+H2O2组比：2)P<0.05

3 讨 论

血管内皮细胞结构与功能的损伤是高血压、冠心病等心血管疾病发生的起始环节，而活性氧(ROS)的产生和清除失衡参与了血管内皮细胞的损伤过程。过量ROS产生会导致中性粒细胞炎性浸润，产生大量氧化中间物，引起蛋白氧化损伤，导致细胞发生氧化损伤〔11〕。SOD是生物体内非常重要的抗氧化酶，广泛存在于动物、植物、微生物中，是清除体内ROS的首要物质。SOD活性的高低是反映机体抗氧化损伤能力的直观指标，可缓解细胞的氧化损伤并可修复受损细胞〔12〕。MDA是膜脂过氧化主要产物之一，MDA含量增多可加剧膜的损伤。通过MDA含量的高低可反映膜脂过氧化的程度，膜系统受损程度可反映细胞受损程度〔13〕。LDH几乎在所有组织中都存在，在心肌梗死、白血病、肾脏疾病、溶血性贫血等疾病LDH含量增高。当细胞膜受损时，细胞外液中的LDH渗出，导致LDH含量增多，因此，LDH含量可反映细胞损伤程度〔14〕。本实验结果说明H2O2可诱导血管内皮细胞发生氧化损伤。上调miR-23b后，血管内皮细胞SOD活性升高，MDA含量和LDH活性降低，说明上调miR-23b可缓解H2O2诱导的氧化损伤。

近年来研究证实，miRNA可作为一类信号调节物质通过调控靶基因及相关信号通路参与多种物种的生命过程，参与调控细胞增殖、分化、凋亡及组织器官的代谢和发育等过程〔15,16〕。miR-23b定位于人9号染色体上，在胰腺癌、肝癌等多种肿瘤中异常表达，发挥抑癌基因或癌基因的作用〔17〕。研究发现，上调miR-23b表达能够抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖，促进3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞〔18〕。在哮喘小鼠的气道平滑肌组织中miR-23b表达量比正常小鼠低，气道平滑肌细胞过度增殖，凋亡减少与miR-23b的表达下降有关〔19〕。由激素诱导的骨微血管内皮细胞损伤可导致miR-23b表达发生明显的变化，miR-23b可调控相关靶基因的转录和表达调控细胞凋亡及血管形成，最终影响激素诱导的股骨头坏死的病理发展过程〔20〕。目前研究显示，Cleaved Caspase-3和Bax是介导细胞发生凋亡的标志性指标，Caspase的活化可引起细胞内DNA内切酶活性增加对DNA进行剪切，引起细胞凋亡。Bax的表达升高可引起Bax/Bcl-2比例上升，引起细胞凋亡〔21,22〕。本实验结果说明miR-23b通过影响凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Bax的表达来调控血管内皮细胞凋亡的过程。

在前列腺癌细胞中，miR-23b能够调控第10号染色体同源缺失性磷酸酶张力蛋白(PTEN)的表达，影响磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路中关键信号因子的表达，促进前列腺癌细胞增殖〔23〕。血管内皮细胞在血流剪切力下观察细胞的生物学特性实验中发现，miR-23b与MAPK信号通路之间存在回馈调节作用〔24,25〕。本实验结果说明miR-23b可减少细胞损伤，降低血管内皮细胞凋亡。miR-23b的表达上调，与MAPK信号通路相关蛋白p38-MAPK和p-p38表达降低，提示miR-23b可抑制MAPK信号通路的激活。加入MAPK信号通路激活剂，可增加上调miR-23b表达抑制H2O2诱导血管内皮细胞的损伤。以上结果说明miR-23b可通过抑制MAPK信号通路的激活抑制细胞损伤和凋亡，对H2O2诱导血管内皮细胞损伤起保护作用。

miR-23b参与血管内皮细胞凋亡和损伤保护的过程，其作用机制与MAPK信号通路的激活有关，在血管内皮损伤引起的心血管疾病发生和发展中具有重要作用，为心血管疾病预防和治疗提供新的切入点。