激素替代治疗解冻移植周期中体外培养时间对卵裂期胚胎移植临床结局的影响

董玲凤，张静雯，黄建洲，池霖生，陈棪焜，马文敏

(南方医科大学附属佛山市妇幼保健院辅助生殖技术中心，佛山 528000)

胚胎玻璃化冷冻解冻技术由于其快速、简便、损伤小、复苏存活率高等优势迅速应用于辅助生殖领域中[1]。多项研究表明冻融胚胎移植(FET)成功率主要与胚胎质量、子宫内膜准备、子宫内膜与胚胎发育的同步性等主要因素有关[2-4]。如何合理把握胚胎“种植窗”提高解冻周期临床妊娠率成为临床医生和胚胎学家关注的重点[5-8]。本研究回顾性分析激素替代周期(HRT)中胚胎解冻后不同的体外培养时间对移植周期临床结局的影响。

一、资料与方法

1.研究对象及分组：收集本生殖中心2016年1月1日至2017年12月31日进行的270个FET周期为研究对象。纳入标准：女方年龄≤35岁，首次解冻移植周期，内膜准备采用HRT方案，移植两枚解冻后卵裂球100%存活的优质卵裂期(D3)胚胎。排除胚胎反复冻融的移植周期。

所有周期按照解冻后胚胎在体外培养时间的不同分为正常解冻组(168个周期)和提前解冻组(102个周期)。正常解冻组：第3天(D3)移植，移植当天早上8～9点解冻，解冻后D3胚胎体外培养2～3 h后移植，移植前0.5 h转入移植液EmbryoGlue(Vtriolife，瑞典)中平衡；提前解冻组：D3胚胎于移植前1 d(D2)下午16～17点左右解冻，解冻后D3胚胎体外培养17～18 h，次日8～9点移植(D3)，移植前0.5 h转入EmbryoGlue液中平衡。

2.主要仪器与试剂：胚胎培养箱(LABOTECT，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯，日本)；体视显微镜(NIKON，日本)；IVF工作站(K-SYSTEMS，丹麦)；玻璃化冷冻套装[含平衡液(ES)、玻化液(VS)]、玻璃化解冻套装(含WS1、WS2、WS3、WS4四种液体)(OrigioMEDICULT，丹麦)；半封闭式载杆(cryotop，加藤，日本)；胚胎培养液IVF-PLUS、G1-PLUS、G2-PLUS、培养油及移植液EmbryoGlue(Vtriolife，瑞典)。

3.研究方法：促排方案的选择、胚胎冷冻及解冻、胚胎移植等按照本中心常规程序进行。胚胎玻璃化冷冻方法：冷冻试剂ES、VS室温平衡0.5 h后，将D3胚胎在200 μl的ES中平衡6～7 min，待其形态恢复后，在100 μl的VS中冲洗数次，胚胎装入载杆，迅速投入液氮，胚胎在VS中的时间到投入液氮整个过程不超过1 min。胚胎玻璃化解冻方法：解冻试剂包括WS1、WS2、WS3及WS4四种液体，提前0.5 h取出1 ml WS1倒入双凹皿中并置于无CO2、37℃培养箱中预温，其余3种液体分别置于室温下四孔板中复温。解冻时，快速将含胚胎载杆段浸入37℃的WS1中，轻晃使胚胎落下，37℃放置1 min，随后在WS2、WS3、WS4-1、WS4-2中分别平衡3 min，最后将胚胎转入6%CO2过夜平衡的G2培养液中，记录卵裂球损伤情况，进行胚胎评分后放置37℃、6% CO2培养箱中。移植前0.5 h将G2内的解冻胚胎转移至胚胎胶中。

胚胎评分标准：本中心主要根据卵裂球数目、均一性及碎片率进行评分。记录卵裂球个数；均一性分3级(1级：卵裂球大小均匀，形态规则；2级：大小略不均匀，形态略不规则；3级：大小明显不均，可有明显的形态不规则)；碎片分4级(1级：无碎片或碎片数量<5%；2级：碎片数量<20%；3级：碎片数量为20%～50%；4级：碎片数量>50%)。D3优质胚胎标准：D3胚胎细胞数为7～9个，细胞均一性为1～2级，碎片1～2级。

HRT及胚胎移植：对于内膜薄、反复排卵周期冷冻移植失败、不明原因不孕症、排卵障碍诱发排卵失败、自然周期异常出血、自然周期排卵异常等患者采用HRT方案。具体流程：子宫内膜厚度达到8 mm或以上时进行子宫内膜转化，72 h后移植。胚胎移植后第14天查尿HCG/β-HCG，确定是否妊娠。如阳性继续用HCG或黄体酮至妊娠10～12周左右，胚胎移植28～35 d后行B超检查，如妊娠囊中可探查到胎芽及搏动的胎心则为临床妊娠。12周前的胚胎停育为早期流产。

4.统计学分析：采用SPSS 17.0软件进行数据统计分析，计量资料比较采用两独立样本t检验，计数定性资料比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.两组一般资料比较：正常解冻组和提前解冻组的女方年龄、体重指数(BMI)、不孕年限、子宫内膜厚度等基本资料比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

2.两组患者临床结局比较：提前解冻组的临床妊娠率(58.82%)略高于正常解冻组(58.33%)，但无显著性差异(P>0.05)；提前解冻组的胚胎种植率(38.73%)略低于正常解冻组(39.58%)，亦无显著性差异(P>0.05)；提前解冻组的流产率(11.67%)有高于正常解冻组(9.18%)的趋势，但两者无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表1 两组患者一般资料比较(-±s)

表2 两组患者临床结局比较(%)

三、讨论

解冻后卵裂期胚胎延长体外培养时间能否提高解冻移植周期的临床妊娠率，一直存在争议。影响解冻卵裂期胚胎临床妊娠率的原因很多，如女方年龄、不孕年限、子宫内膜厚度、胚胎质量、内膜准备方式、移植胚胎数及解冻后卵裂球损伤等[9-13]。在本研究中，限制研究对象为首次解冻移植周期、内膜准备为HRT方案、女方年龄≤35岁的年轻不孕患者，排除了年龄、内膜准备方式、FET重复失败周期等的影响因素；只纳入移植两枚解冻后完整存活的优质卵裂期胚胎的周期，排除了明显冷冻损伤的卵裂球对胚胎种植率及临床妊娠率等方面的影响，以尽量去除干扰因素，使结果更加客观、准确。

本研究结果表明对于≤35周岁、HRT-FET移植2枚完整存活的优质卵裂期胚胎的年轻不孕人群，延长体外培养时间并不能显著提高其临床妊娠率，提示胚胎质量对临床妊娠结局有重要影响，解冻后卵裂球完好的优质胚胎可能由于有较好的发育潜能，在体内、外都有很强的适应能力，故不同解冻时间组的临床结局无显著性差异，这一结果与刘晓音等[14]在研究中提到延长体外培养时间并不显著影响玻璃化冻融胚胎发育潜能的结论相似。罗金等[15]的研究也认为次日移植并不能提高临床妊娠率和种植率，反而增加了流产率。本研究结果亦表明延长解冻胚胎的体外培养时间可能使早期流产率有增加趋势，但目前尚无显著性差异。之前有研究认为胚胎解冻后过夜培养，有卵裂球细胞生长的胚胎能够获得较高的种植率、妊娠率，生长为桑葚胚者能够获得较好的妊娠结局[9-13]，说明延长体外培养时间可能有利用选择更好发育潜能的胚胎，提示我们对于质量较差或者细胞数较少的冷冻胚胎，可以选择延长体外培养时间来进一步筛选有较好发育潜能的胚胎。

综上所述，对于拥有冻融优质卵裂期胚胎的年轻患者而言，延长解冻胚胎的体外培养时间并不能更加改善其临床结局，提示我们在临床工作中可灵活安排胚胎的解冻和移植时间。但由于本研究样本量较小，研究结论可能存在一定的局限性，后续研究应扩大样本量，完善研究设计后进一步加以探索。