FMR1基因CGG重复序列多态性与不明原因早期自然流产的相关性研究

冯旺琴，陈素文*，武淑英，陈雁鸣

(1.首都医科大学附属北京妇产医院计划生育科，北京 100026；2. 北京大学第三医院妇产科，北京 100083)

流产分为早期流产和晚期流产，在所有临床确认的妊娠中，约10%～15%会发生早期自然流产[1]。自然流产的病因较复杂，包括内分泌功能异常、解剖学因素、遗传学因素、免疫学因素、感染性疾病、父母双方高龄及其他未知因素[2]。近年来，自然流产的发病率逐年升高，严重影响了女性的生殖健康和心理健康，其具体发病机制仍不十分清楚，目前认为遗传因素在其中发挥了重要作用[3]。脆性X智力障碍1号基因(FMR1)的5’端非编码区有一个不稳定的CGG三核苷酸串联重复序列，该基因又称家族性智力低下基因，位于染色体Xq27.3处，1991年由荷兰科学家Verkerk等[4]发现，当FMR1基因5’端非编码区CGG重复序列异常扩增时，其蛋白产物FMRP(主要在大脑和睾丸组织中表达)显著减少，当扩增达到200 bp以上，往往伴随着超甲基化，最终使得新生儿缺乏FMRP，引起智力障碍[5]。

国内外不同种族人群FMR1基因CGG重复序列多态性存在差异，我国尚未见到该基因大样本育龄女性的数据。自然流产夫妇FMR1基因CGG重复序列多态性是否高于普通人群，需要进一步研究。本研究通过回顾性分析探讨不明原因早期自然流产与FMR1基因CGG重复序列多态性变异程度之间的关系，为自然流产的病因学研究及临床诊疗提供参考，也为自然流产患者再次妊娠前进行遗传咨询提供指导。

资料与方法

一、研究对象

研究对象包括自然流产组与对照组。

收集2015年5月1日至2018年4月1日期间在首都医科大学附属北京妇产医院计划生育科就诊的患者，难免流产或超声检查发现胚胎停育(未见胎心搏动、无胚芽等)需要清宫终止妊娠的孕妇，一共2 000例，为自然流产组，发生1次及1次以上不明原因的自然流产，年龄20～46岁。排除标准：生殖道畸形、全身性感染、外力撞击、负重等因素。

收集同期在北京妇产医院产科就诊的1 480例顺利分娩正常新生儿的女性为对照组，年龄23～45岁。

自然流产组和对照组均为汉族。所有研究对象均自愿进行该项检查，并签署知情同意书。

二、实验方法

所有研究对象于孕早期或孕中期进行FMR1基因检测。抽取研究对象外周静脉血2 ml，以Magen全血DNA提取试剂盒(Magen，美国)提取基因组DNA，利用脆性X-FMR1基因Amplide X检测技术(Asuragen，美国)进行CGG重复序列数检测。反应体系为三引物(FMR1上、下游引物、上游CGG引物各0.5 μl)进行PCR扩增，扩增条件按试剂盒说明书要求设置。

详细记录本实验所有研究对象的各项资料，结合FMR1基因突变筛查所得结果，对相关数据以及研究对象的各种临床资料进行比较分析。采用目前国内外普遍采用的分类：(1)正常重复范围(n=5～44次)；(2)中间型(intermediate)或者灰区(gray zone)(n=45～54次)；(3)前突变(premutation)(n=55～200次)；(4)全突变(full mutation)(n>200次)[6]。

三、统计学方法

结 果

一、患者一般情况比较

自然流产组孕周5～12周，平均(8.6±2.2)周。其中孕周<9周的1 035例，孕周≥9周的965例。初次自然流产1 337例，复发性流产(流产次数≥2次)663例。孕次1～6次，产次0～1次。孕妇年龄>35岁998例，年龄≤35岁1 002例，平均年龄(31.5±3.3)岁。

对照组平均年龄(30.8±3.2)岁，孕次1～7次，产次1～3次；孕妇年龄>35岁678例，年龄≤35岁802例。两组病例年龄比较无统计学差异(P>0.05)。

二、两组CGG重复序列分布规律比较

自然流产组患者FMR1基因检测及统计结果显示：CGG重复最大频率等位基因n=30，其次为29，再其次为36和31。对照组最大频率等位基因n=30，其次依次是29、36和31，两者高度一致。自然流产组检测到35种不同的等位基因，CGG重复次数变异范围n=21～133，最大频率等位基因为n=30(659/2 000，32.95%)，其后依次是n=29(623/2 000，31.15%)、36(312/2 000，15.60%)、31(117/2 000，5.85%)。对照组检测得到25种不同的等位基因，CGG重复次数变异范围n=22～58，最大频率等位基因n=30(492/1 480，33.24%)，其后依次是n=29(377/1 480，25.47%)、36(218/1 480，14.73%)、31(124/1 480，8.38%)。自然流产组及对照组CGG重复均数分别为(29.33±5.19)、(28.73±6.37)次，二者比较差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 两组FMR1基因CGG重复序列分布比较[n(%)]

本研究将中间型(灰色区域)CGG重复次数扩增范围定为45～54，检出自然流产组FMR1基因的中间型患者9例，FMR1基因中间型携带率为1∶222；对照组中FMR1基因的中间型6例，FMR1基因中间型携带率为1∶247。二者比较差异无统计学意义(P>0.05)。

自然流产组中FMR1基因前突变(PM)携带者5例，携带者的频率1∶400。对照组中前突变携带者2例，携带者的频率1∶740。二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

所有病例均未发现FMR1全突变基因(>200 CGG)。

讨 论

自然流产是一种较为常见的妊娠并发症，可能与染色体异常、免疫因素、遗传因素等有关，但临床上仍有约50%的患者病因不明确。

脆性X综合征，是一种常见的遗传性智力低下疾病，其致病基因为脆性智力障碍基因。FMR1基因CGG重复次数的变化与临床意义紧密相关，根据不同的扩增概率，目前国内外普遍采用美国医学遗传学和基因组学学会的建议，将CGG重复序列分为4类，第1类“正常”，表明未受累型，CGG重复数5～44之间，一般情况下未受累人群传代过程中CGG重复序列稳定，其后代不会因为CGG扩增的原因导致脆性X综合征，因此受检者不必进行产前诊断[3]；第2类中间区域，或者“灰区”，重复数45～54次之间，受检者本身没有临床症状，其后代也不会因为CGG的扩增导致脆性X综合征，可不建议进行产前诊断，但后代有可能扩增成为携带者，可以检测其后代的FMR1基因；第3类，“前突变”序列，55～200次之间，即突变携带者，后代有很大的扩增风险，因此需要进行产前诊断和遗传咨询；第4类，“全突变”序列，CGG重复数>200次，为完全突变型，大约50%的女性为脆性X综合征患者，50%可能没有症状，需要进行产前诊断[6-8]。

本研究样本发现，自然流产组和对照组频率最高的CGG重复数都是30、29，其次为36、31。国内张有成等[9]报道频率最高的CGG重复数是29个CGG重复，其次为30和31个CGG重复，再其次为36和37个CGG重复。与本研究高度一致。巫向前等[10]报道FMR1等位基因在汉族人群中没有区域差异，最常见的重复数为29，其次为36。刘帆等[11]研究报道乌鲁木齐市汉族育龄女性的FMR1基因中最常见的CGG重复数为29(41.33%)，其次为30(28.06%)。马云等[12]研究汉族和壮族人群的最大峰值分别为28和29，序列范围为6～43，其中CGG重复序列范围主要为27～30。本研究与国内报道基本相符。

自然流产组FMR1基因的灰色区域患者9例，FMR1基因灰色区域携带率为1∶222，对照组灰色区域携带者6例，携带率为1∶274，均为汉族育龄女性。刘帆等[11]报道乌鲁木齐市汉族育龄女性FMR1基因突变灰色区域携带率为1∶98，高于本研究结果。自然流产组脆性X综合征前突变携带者5例，携带者的频率1∶400。Lu等[13]对122例卵巢早衰汉族女性进行检测，前突变携带率1∶122，高于本研究病例。美国研究结果显示FMR1基因CGG重复序列的女性全突变患病率报道范围为1∶8 000到1∶2 500，中间型(n=45～54)发病率为1∶66，明显高于本研究的1∶222和1∶247；前突变(n=55～200)的携带率为1∶113到1∶382[8，14-15]，与本研究自然流产组的1∶400接近，明显高于本研究对照组的携带率1∶740。

中国台湾地区、韩国开展了FMR1基因CGG重复序列检测的相关研究。韩国进行的FMR1基因回顾性研究结果显示前突变的患病率为1∶788，中间型(n=45～54次)的携带率为1∶137[16]，显著低于西欧等其他国家的报道。也低于本研究自然流产组前突变的携带率，但与对照组基本一致。中国台湾地区开展的脆性X综合征相关新生儿筛查研究估计该地区的发病率为1∶10 046[17]，也明显低于非亚洲地区的发病率报道。

研究发现，FMR1基因前突变与卵巢早衰之间具有显著相关性，前突变患者卵巢早衰发病率高达13%，自然绝经时间较早，有关卵巢储备功能相关的指标：血清抗苗勒管激素、基础FSH水平等出现异常[18-19]。对于前突变携带者女性，建议进行遗传咨询，同时进行产前诊断，随着年龄增长，卵巢储备功能下降，绝经可能提前，卵细胞质量下降，导致妊娠丢失，推迟生育可能不是一个好的选择[20-22]。美国妇产科学院建议存在风险的女性在40岁之前进行基因突变筛查，前突变携带者风险增高，需要评估卵巢储备功能，如基础窦卵泡数或者卵巢储备功能，建议患者在卵巢功能下降之前怀孕，以避免妊娠的丢失。随着目前我国二胎的全面开放，二胎生育年龄明显推迟，高龄尤其40岁以上的女性希望生育二胎比例明显增加，对我国高龄女性进行基因突变筛查同样重要。

本研究发现自然流产组FMR1基因的前突变型携带比例显著高于对照组，其原因尚不明确。提示FMR1基因CGG重复序列前突变与不明原因早期自然流产可能存在相关性。Kline等[23-24]曾推测流产的增加可能与卵巢卵母细胞池的减少有关，FMR1基因的前突变携带者，卵巢储备功能下降，二者之间可能存在某种关联。本试验尚未对所有研究对象的卵巢储备功能相关指标进行对比研究，后续研究需进一步完善。

对所筛查出的FMR1前突变基因携带者的临床特点进行分析，发现5例患者有3例有2次自然流产史，2例1次自然流产史，等位基因n=62、70、81、83、133，均尚未分娩。对照组2例前突变携带者，分娩时年龄为29岁、32岁，等位基因均为n=58，其中1例第1次足月分娩，另1例为二胎，曾有1次人工流产史，均无不良孕产史，新生儿均正常。Strom等[25]进行了119 232例脆性X综合征检测和307例产前检查，发现1.7%FMR1基因前突变，当胎儿遗传了一个扩大的母体等位基因，对于<50、50～75、76～100、>100重复序列的等位基因，扩展到一个完整的受影响的等位基因的风险分别是0%、5%、30%和100%。这些数据有利于携带者的遗传咨询和脆性X综合征的产前诊断。CGG重复区域内AGG插入位置和数量，被认为是在子代传递传过程中，有利于减少扩增为全突变的可能性[26]。

女性携带者在传代过程中易发生CGG重复序列的进一步扩展，发病风险呈逐代递增趋势。对于中间型的等位基因，在子代传递中的扩增风险尚缺乏有力依据，给孕妇或孕前的女性提供遗传咨询时，要考虑到在子代传递过程中重复序列的不稳定性。前突变患者应告知子代传递中有明确的扩增为全突变的风险，并根据风险概率向前突变携带者提供合理的生育建议[27]。对于携带者，进行产前风险评估做出合理的生育计划，告知生育的可能性和途径，获得成功的生殖结局[28]。部分脆性X综合征患者外周血中的CGG重复状况不能取代其他组织中的情况，遗传检测和咨询环节一定要注意FMR1基因CGG重复序列的组织异质性。检测中应明确CGG重复数目、AGG插入模式和FMR1甲基化情况3个重要因素，以此评估个人致病风险及生殖传递过程中的风险。本研究仅对外周血CGG重复序列进行研究，有一定局限性，需要进一步完善。

本研究认为FMR1基因CGG重复序列位于中间型及以上的妇女应引起产前诊断及遗传咨询的足够重视。Saul等[29]对美国南卡罗来纳州出生后的1 459例新生儿进行了测试，获得了5个异常结果，包括1个性染色体非整倍体(47，XXY)、2个前突变和2个全突变，脆性X综合征检测率为1∶730，对新生儿的筛查有潜在的可行性，但评估、人口效益尚不能用于常规筛查。Hill等[30]对新生儿和妊娠前或妊娠期间的育龄妇女进行脆性X综合征的人群系统筛查，发现除了医学问题，更要注意筛查者的心理问题和教育支持，避免过度的焦虑和失望。

后续我们仍需进行大规模的研究，了解中国育龄女性人群中FMR1基因突变的特点、其与临床表型的关系以及对子代的影响，对其进行针对性的遗传咨询及指导，筛查潜在高危因素的孕妇，以提升脆性X综合征的产前检出率，达到优生优育。这些数据资料也为筛选中国人群中脆性X综合征的患者和携带者提供了依据。