乙醇作用时间对大鼠子宫内膜损伤的影响

南楠，梁敏，刘婷婷，陈西华，王树芳，汪坤，祝立权，张博男，贺斌，徐祥波*

(1.国家卫生计生委科学技术研究所，北京 100081；2.北京协和医学院研究生院，北京 100730；3.新乡医学院，新乡 453003)

子宫内膜的修复障碍大部分由炎症和手术所致[1]，而主要原因是流产时刮宫术引起的子宫损伤导致的宫腔粘连。据文献报道，造成宫腔粘连的手术类型以妊娠期手术操作最多，占比93.01%，其中早孕期清宫占比54.59%[2]。宫腔粘连是指子宫的创伤导致子宫内膜基底层受损，使宫腔部分或全部闭塞从而导致月经异常、不孕或反复流产等。不孕不育是生殖领域亟需解决的一大问题，而胚胎和子宫是成功妊娠的两个重要因素。宫腔粘连是导致妊娠失败子宫方面的主要因素[3-4]，给许多女性生活带来极大的困扰。目前，宫腔粘连形成的确切机制尚不清楚。

子宫内膜损伤实验动物模型的建立是研究薄型子宫内膜/宫腔粘连的重要平台。本研究中，根据以往对子宫损伤模型相关文献的阅读[5]，参考已经使用得比较成熟的对大鼠子宫造成化学损伤的试剂，我们采用95%乙醇损伤大鼠子宫内膜，观察95%乙醇不同作用时间下子宫内膜的损伤修复情况，旨在探讨不同乙醇作用时间对子宫内膜损伤修复的影响，以及建立优化的大鼠子宫内膜损伤模型。

材料与方法

一、实验动物及试剂

1.实验动物：8～10周龄性成熟且未交配的雌性SD 大鼠，SPF级，由北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]提供。于国家卫生计生委科学技术研究所[SYXK(京)2009-0033]饲养，室温23～25℃，湿度67%～75%，光照明暗时间比为14 h/10 h，能自由获取充足的食物和水。按照性周期一致性原则，每笼饲养3只大鼠。

2.主要实验试剂：95%乙醇(北京化工厂)，苏木精-伊红染液(北京中杉金桥)，天狼星红染液(上海翊圣生物)

3.主要仪器：生物组织包埋机(浙江科迪仪器设备)，蜡块切片机(Leica，德国)，光学显微镜(Leica，德国)，偏振光显微镜(上海蒲拓光电仪器)

二、研究方法

1.SD大鼠子宫内膜损伤实验：将25只SD大鼠随机分为5组，每组5只，一组仅开腹缝合作为对照组，另外4组为实验组，分别以95%乙醇作用15 s、30 s、60 s、120 s。用10%水合氯醛溶液进行麻醉，注射剂量为3 ml/kg，麻醉后放入无菌手术台，仰卧，消毒后腹部阴道口向上1 cm左右进行开口，轻轻夹出V型子宫，用动脉夹夹住子宫近阴道端，用注射器分别向子宫推入300～500 μl 95%乙醇，使子宫保持充盈状态。作用结束后将95%乙醇吸出，并用生理盐水洗涤子宫腔3遍，将子宫塞回，缝合伤口并消毒放回。每组5只大鼠。术后7 d 脱颈处死SD大鼠，获取大鼠子宫，进行拍照并固定于4%多聚甲醛。

2.组织形态学观察：大鼠子宫组织于4%多聚甲醛固定后，取子宫中间部分进行常规石蜡包埋，5 μm厚度进行切片，脱蜡，水化，进行HE染色观察子宫组织形态学，天狼星红染色观察其偏光镜下纤维化程度。

3.腺体数及子宫内膜厚度统计和分析：每组大鼠子宫随机选取5张切片进行HE染色，计数每张片子宫内膜腺体数目，取其平均值。子宫内膜厚度则是每组随机选取5张切片，4个方向用显微镜测微尺测量厚度，求取每一张片子厚度平均值后，并求取5张片的子宫内膜厚度平均值。

三、统计学方法

采用Excel进行统计学分析。实验数据以(平均数±标准差)表示，多样本均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两样本之间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、95%乙醇不同作用时长下大鼠状况

实验组和对照组的大鼠在术后1周内状态良好，眼神有光，毛色顺亮，精神状态良好，无死亡，饮食正常，排泄正常。

二、子宫形态学变化

1.大鼠子宫形态：术后7 d，对照组子宫较细，整体粗细均匀一致，外观平整光滑，富有弹性(图1A)；95%乙醇作用15 s组子宫与对照组无太大差异(图1B)；作用30 s组子宫出现淤血，有水肿现象存在，管壁呈红色子宫外观较光滑(图1C)；作用60 s组子宫管壁表面出现皱痕，有明显淤血，子宫内膜有出血残留的血凝块(图1D)；而作用120 s组子宫壁粗糙，形态不规则，且韧性极差，整个子宫均出现出血造成的血凝块，损伤严重(图1E)。

2.组织HE染色：相对于对照组(图2A/a)，95%乙醇作用15 s组出现子宫内膜纤维化，有轻度的宫腔黏连现象，部分子宫腔上皮脱落，症状较轻，腺体分布不规律，较紊乱(图2B/b)；乙醇作用30 s组子宫内膜腔上皮细胞已经全部损伤，几乎无腺体存在，出现更严重一些的宫腔粘连，子宫内膜纤维化程度加重(图2C/c)；乙醇作用60 s组子宫内膜已经开始出现凝固性坏死，子宫内膜大面积损伤脱落，子宫宫腔变大，子宫内膜基底层也受到了一定的影响(图2D/d)；乙醇作用120 s组子宫内膜腔上皮至基底层全部损伤，形成空腔，出现更大的面积的凝固性坏死，已形成不可修复的子宫内膜的损伤(图2E/e)。

A：对照组；B～E：95%乙醇分别作用15 s、30 s、60 s、120 s图1 95%乙醇不同作用时长下大鼠子宫形态的比较

A、a：对照组；B～E、b～e：95%乙醇分别作用15 s、30 s、60 s、120 s(A～E为5倍视野下观察结果，a～e为上图标注*处20倍视野下放大结果)图2 95%乙醇作用不同时长下的子宫内膜形态(HE染色)

3.子宫内膜腺体数量和子宫内膜厚度：子宫内膜腺体数量方面，与正常对照组相比，从95%乙醇作用15 s开始其腺体数目显著减少(P<0.05)，至作用120 s时，镜下已经基本检测不到腺体的存在(图3A)，而各处理组之间腺体的数量无显著差异(P>0.05)；在子宫内膜厚度方面，乙醇作用15 s和30 s的处理组中大鼠子宫内膜的厚度与对照组无显著差异(P>0.05)，随后在95%乙醇作用60 s处理组中子宫内膜开始变薄，至120 s大鼠子宫内膜厚度均比正常对照组薄(图3B)，并且与正常对照组相比均具有显著性差异(P<0.05)。

NC：对照组；与对照组比较，*P<0.05图3 95%乙醇作用不同时长后腺体数目和子宫内膜厚度的比较

4.组织天狼星红染色：我们对大鼠子宫组织进行切片，用天狼星红染色。天狼星红染液为强酸性染料，与胶原分子中的碱性基团结合被染成红色，在偏振光镜下对纤维化病变分型和分级有帮助作用。从天狼星红染色可以看出，95%乙醇的作用的确已经对子宫内膜产生了损伤，并使子宫发生了纤维化(图4A～E)。但是就天狼星红结果而言，并未发现明显的组间差异。

A：对照组；B～E：95%乙醇分别作用15 s、30 s、60 s、120 s图4 95%乙醇作用不同时长下的子宫内膜形态(天狼星红染色×4)

讨 论

我们采用化学损伤法设计、建立和优化大鼠子宫内膜损伤模型。目前，子宫内膜损伤模型建立的方法主要有热损伤法[6]、吸宫法、电凝法[7]、机械损伤法[8]、化学损伤法[5]和联合使用法[9]。其中热损伤法利用的是“热球”内膜去除原理，手术置入宫腔导管，利用温度造成子宫内膜损伤；吸宫法是利用负压对子宫内膜进行吸宫，造成损伤；电凝法是利用电击的方法对子宫内膜进行损伤；机械损伤是利用刮匙对子宫内侧进行刮伤；化学损伤法则是利用酒精对子宫内膜进行损伤。本研究经过比较决定采用化学损伤的方法，建立子宫内膜宫腔粘连模型。已有文献报道用95%酒精建立了大鼠薄型子宫模型[10]和宫腔粘连酒精损伤模型[11]，作用时间分别为5 min和3 min。为了验证95%乙醇损伤子宫造模的最佳作用时长，我们开始观察和验证不同作用时间下的子宫内膜状态。

目前而言，做子宫内膜损伤模型常用的动物是兔子[12]、大鼠[13]和小鼠[14]。根据生长周期，手术操作难易等各方面综合考虑，我们决定采用大鼠。大鼠生长周期较短，麻醉开口较简单，且子宫大小合适，手术方便，其动情周期较规律易观察。

本研究可看出，95%乙醇作用15 s的一组，其子宫子宫腔有部分损伤，且腺体减少，有纤维化现象；作用30 s后的子宫，腔上皮细胞全部脱落，且纤维化程度更加严重，基底层细胞排列凌乱，数量减少，存在一定的自我修复现象，且形成了宫腔粘连；而95%乙醇作用60 s和120 s的子宫形成较大的子宫腔，基层已经受到一定或彻底的损伤，自我修复能力几乎为零。根据与临床观察结果相比较，95%乙醇作用15～30 s的损伤程度能有效地模仿临床刮宫效果，建立大鼠宫腔粘连模型。

另外，通过子宫内膜腺体数量统计分析发现，不同乙醇作用时长的实验组子宫内膜的腺体数量明显减少，说明95%乙醇能够影响子宫内膜腺体的数量。大鼠子宫内膜厚度统计结果显示，95%乙醇作用时长在15 s和30 s时子宫内膜厚度与对照组相比并无太大变化，作用时长在60 s时子宫内膜厚度明显比正常对照组薄，而作用时长为120 s时子宫内膜厚度仅为正常对照组的1/3左右。以往文献报道，正常女性子宫壁厚度在10～10.6 mm左右[15]，对243例刮宫术术后患者子宫内膜厚度分析，刮宫一次的患者子宫壁厚度均值在9.66～9.85 mm左右，刮宫两次的患者其子宫壁厚度约在8.9～8.92 mm左右，刮宫三次及四次者其均值约在7.32～7.70 mm之间。因此，在本研究中，推荐在本动物模型中95%乙醇处理时间在15～30 s之间最为合适，对子宫内膜的损伤程度可能贴近临床上的刮宫损伤程度，以满足临床不同程度内膜损伤机理的研究。