外泌体在肿瘤疾病诊断中的研究进展

王 琪， 王保龙

（安徽医科大学附属省立医院检验科，安徽 合肥 230000）

外泌体是由细胞主动分泌的大小均一、直径为40～100 nm的脂质双分子层结构小囊泡[1]。外泌体的发现至今已有30多年的历史，最初是由JOHNSTONE等[2]发现的羊成熟网织红细胞释放的一种膜性小囊泡。此后的研究结果显示，外泌体可由树突细胞、淋巴细胞、血小板、肥大细胞 、内皮细胞 、成纤维细胞 、间充质干细胞和肿瘤细胞等不同类型细胞的脱落释放，而且其广泛分布于各种体液中，如血液、尿液、唾液、脑脊液、乳汁、羊水、腹水等[3]。学者们最初认为外泌体发挥类似细胞垃圾袋的作用，将细胞不需要的物质运输出细胞。而近年来发现，外泌体是具有功能活性并可进行细胞间信息传递的分泌微囊泡，这种纳米级膜泡中含有受体、生物活性脂类物质、蛋白质和重要遗传物质如mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）及片段化DNA等组分，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生、免疫反应和肿瘤细胞生长等过程[4]。

近年来，外泌体作为疾病诊断的生物标志物已逐渐成为研究热点。外泌体作为细胞间通讯信息交换的生物载体，在国内外已开展了细胞间信号转导、肿瘤诊断及靶向治疗等领域的研究。越来越多的研究结果显示，外泌体与肿瘤有着密不可分的关系，外泌体参与了肿瘤发生、发展的很多过程，包括肿瘤转移及血管新生、抗肿瘤免疫、肿瘤免疫逃逸等[5]。肿瘤在生长过程中会不断地将外泌体释放到周围环境中，在体内有较长的半衰期，且易于从体液中分离，而且外泌体内含有肿瘤细胞来源相关的多种蛋白质、脂类和核酸，因此也可作为生物标志物用于肿瘤的辅助诊断、疗效评价以及预后监测等[6]。另外，糖尿病、人类免疫缺陷综合征、慢性炎症疾病、心血管疾病、神经系统疾病及自身免疫性疾病患者细胞外囊泡水平均升高[7]，因此外泌体也有望成为诊断这类疾病的生物标志物，具有广阔的临床应用前景。

肿瘤是威胁人类健康和生存最主要的疾病之一，早期发现难、治愈率低、预后差。肿瘤的早期诊断能够降低患者死亡率。然而，目前临床上尚缺乏有效的早期诊断方法，亟需寻找可以应用于肿瘤早期诊断的生物标志物[8]。随着相关技术的不断进步，越来越多的研究者将目光投向了外泌体在肿瘤发生、发展中的作用及其临床应用。外泌体内容物繁多且复杂。目前，ExoCarta数据库收录了11 261种蛋白、194种脂类、2 375种mRNA和764种miRNA[9]。外泌体在所有类型的体液中均可被检测到，肿瘤细胞可以比正常细胞分泌更多的外泌体进入体液中，且肿瘤外泌体的分子特征能部分反映来源肿瘤的表型，因此外泌体有成为新的肿瘤诊断标志物的潜力[10]。文章就外泌体在肿瘤诊断应用中的研究进展作一综述。

1 外泌体核酸

肿瘤细胞分泌的外泌体中携带的miRNA、mRNA、长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）及DNA等核酸分子是最受关注的一类可作为肿瘤诊断生物标志物的分子。这些分子反映了分泌细胞的生理状态和功能状态，甚至还会包含细胞病态相关的分子信息，尤其是肿瘤细胞来源的外泌体含有的miRNA具有异质性，这就使得外泌体源性miRNA有可能成为肿瘤诊断的新指标[11]。近年来的研究结果显示，肿瘤细胞分泌的外泌体中的DNA、mRNA及lncRNA可反映肿瘤患者的病理生理状态及原发肿瘤的性质，有望作为诊断肿瘤的指标[12]。

1.1 呼吸系统肿瘤

CAZZOLI等[13]对肺腺癌患者、肺肉芽肿患者、健康吸烟者的研究结果显示，血浆外泌体中的4种miRNA（miRNA-378a、miRNA-379、 miRNA-139-5p和miRNA-200b-5p）可用于肺癌的筛查，另6种miRNA（miRNA-151a-5p、miRNA-30a-3p、miRNA-200b-5p、miRNA-629、miRNA-100和miRNA-154-3p）可用于肺癌的诊断。SILVA等[14]的研究结果显示非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）外泌体中的 miRNA 表达谱与正常组织存在差异，其中let7f 和miRNA-30e-3p的表达水平可区分早期和晚期 NSCLC患者，并且二者表达水平与患者较差的预后有关。由此可见，循环外泌体源性miRNA或可作为肺癌早期诊断的非侵入性生物标志物。

1.2 消化系统肿瘤

恶性食管鳞状细胞癌患者外泌体miRNA-21显著高于良性反流性食管炎患者，外泌体miRNA-21的高表达往往预示着癌细胞的广泛浸润和癌症复发[15]。MADHAVAN等[16]的研究结果显示胰腺癌患者外泌体中4种miRNA（miRNA-1246、miRNA-4644、miRNA-3976和miRNA-4306）呈特异性高表达，而正常对照者则很少表达。OGATA-KAWATA等[17]的研究结果显示原发性大肠癌患者有7种miRNA（let-7a、miRNA-1229、miRNA-1246、miRNA-150、miRNA-21、miRNA-223和miRNA-23a）的表达显著高于健康对照者。WANG等[18]的研究结果显示，结直肠癌患者血清环状RNA（circular RNA，circRNA）与正常对照者比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示循环血液中的circRNA对肿瘤具有重要的诊断价值。张云等[19]的研究结果显示，血清外泌体来源的miRNA-122诊断肝癌的敏感性为81.93%、特异性为82.05%，提示外泌体源性的miRNA-122可作为一种新的肿瘤标志物用于原发性肝癌的早期诊断。另外，肝癌细胞来源的外泌体携带的lncRNA TUC339 明显升高，也可用于肝癌的诊断[20]。LI等[21]的研究结果显示，胃癌患者血液中的lncRNA LINC00152 主要富集在外泌体中，可促进胃癌进展，也可用于胃癌的诊断。由此可见，外泌体在消化系统肿瘤中具有重要的临床价值，应用前景广阔。

1.3 泌尿系统肿瘤

BRYANT等[22]通过分析前列腺癌患者和正常对照者血液和尿液的外泌体，发现miRNA-141和miRNA-375或可作为诊断前列腺癌的生物标志物。MOTAMEDINIA等[23]的研究结果显示尿液中外泌体的mRNA可用于鉴别前列腺癌和良性增生性疾病，尿液中外泌体的基因检测可代替病理活检来鉴别前列腺癌及单纯前列腺特异性抗原升高的疾病。LONG等[24]采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）芯片对膀胱移行细胞癌患者和健康对照者外泌体中的236种miRNA进行分析，其中7种miRNA表达有差异，这7种miRNA诊断膀胱移行细胞癌的敏感性和特异性分别为88%和78%，提示miRNA可作为膀胱癌的诊断标志物。

1.4 生殖系统肿瘤

TAYLOR等[25]的研究结果显示，卵巢癌患者与正常人血液中外泌体的miRNA图谱有明显差异，卵巢癌患者血清中的外泌体中有8种miRNA表达显著升高，提示外泌体有助于卵巢癌的诊断。HANNAFON等[26]发现，乳腺癌患者血浆中外泌体miRNA-1246 和miRNA-21表达显著高于健康对照者（P值分别为0.03、0.04），表明外泌体中的miRNA可用于生殖系统肿瘤的诊断。

1.5 其他肿瘤

在其他系统肿瘤的研究中，MANTEROLA等[27]对比了恶性脑胶质母细胞瘤患者及正常对照者的血清外泌体，利用基因芯片技术筛选出表达差异最大的miRNA-574-3P、miRNA-320及RNU6-1，同时证实RNU6-1单独或多个miRNA联合可特异性地诊断恶性胶质母细胞瘤。ROCCARO等[28]的研究结果显示，miRNA-15a在多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的外泌体中的表达明显下调，与多发性骨髓瘤的特性密切相关。

存在于循环外泌体中的核酸分子具有作为肿瘤早期诊断标志物的潜力，虽然具体作用机制还有待深入研究，但其在各种肿瘤的临床诊断中已表现出巨大的潜力。越来越多的研究者正致力于在循环体液中放大这种分子，使其变为诊断工具，从而促进肿瘤液体活检的发展，为肿瘤的早期诊断打开了一扇新的大门。

2 外泌体蛋白质

外泌体中的蛋白质成分复杂，大体可分为2类：一类是外泌体中普遍含有，参与其结构形成的蛋白质；另一类是与细胞来源有关的蛋白质，如肿瘤细胞产生的外泌体中人凋亡相关因子配体（human factor-related apoptosis ligand，FasL）、肿瘤坏死因子凋亡相关配体（tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand，TRAIL）和转化生长因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）等肿瘤抗原和免疫抑制蛋白[29]，这使得外泌体在肿瘤及相关疾病的诊断中具有重要的潜在价值。

2.1 外周血中与肿瘤相关的外泌体蛋白标志物

LI等[30]的研究结果显示，胃癌细胞高表达CD97，可调节肿瘤细胞的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，促进肿瘤细胞的增殖与侵袭。因此，外泌CD97或可作为一种有潜在价值的胃癌诊断指标。与正常人相比，胃癌患者血液外泌体中人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）、人趋化因子受体6（human chemokine receptor 6，CCR6）的表达会明显升高[31]。众多肿瘤的外周血外泌体中多种蛋白存在异常表达。见表1。

表1 外周血中与肿瘤相关的外泌体蛋白标志物

2.2 尿液中外泌体在肿瘤诊断中的研究进展

尿液样本不仅容易获得，而且收集简便、无创、数量大。因此，尿液中外泌体的检测对于泌尿系统肿瘤的早期诊断、预后判断等无疑是个福音。NILSSON等[37]的研究结果显示前列腺癌患者尿液外泌体中可检测到跨膜蛋白酶、丝氨酸2-ETS基因、β-连环蛋白和前列腺癌抗原3等前列腺癌相关的分子。BECKHAM等[38]通过抽提尿液外泌体发现，膀胱癌患者外泌体中表皮生长因子样重复折叠1结构域蛋白3抗体（epidermal growth factor-like repeats and discoidin 1-like domains-containing protein 3，EDIL3）水平远高于正常人，可作为膀胱癌早期诊断和良好预后的标志物。

3 其他体液中的外泌体在肿瘤诊断中的研究进展

除外周血和尿液外，胸水、腹水、唾液、乳汁等体液中的外泌体也具有诊断相应组织器官肿瘤的潜力，而且比血液、尿液中的外泌体有更强的器官特异性[39]。YANG等[40]的研究结果显示唾液囊泡中的 hCD63 mRNA和GAPDH mRNA 有助于辅助诊断肺癌。WELTON等[41]在研究脑胶质瘤细胞时发现外泌体携带的 miRNA-19a 可靶向肿瘤细胞内的第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10 ，PTEN）mRNA，从而影响肿瘤细胞内PTEN蛋白的表达，促进肿瘤脑转移。SHIMODA等[42]的研究结果显示，组织金属蛋白酶抑制剂可以减少肿瘤基质细胞释放促进肿瘤生长的外泌体，这类细胞释放的外泌体可以提高乳腺癌细胞的运动性。此外，胃癌患者腹水中外泌体表达的CD63、癌胚抗原、FasL、TraiL等也有作为胃癌生物标志物的潜力。除上述体液外，肺泡灌洗液、卵泡液中也发现了外泌体，在肿瘤、生殖功能、呼吸功能的诊断中有重要价值[43]。

4 结语和展望

外泌体是一类携带多种有生物学活性物质的膜性囊泡，可作为一种无创或微创的非侵入性疾病诊断手段，在一定条件下能代替组织活检，以减轻患者的痛苦，提高疾病早期诊断率。肿瘤源性外泌体作为一种新的肿瘤标志物，在肿瘤的早期诊断、疾病监测及预后评估中有着较好的应用前景。另外，外泌体在心血管疾病、感染性疾病等非肿瘤疾病中的应用也颇受关注。目前，外泌体中作为疾病诊断生物标志物的物质主要是核酸和蛋白质，在后续研究中脂质等也有望成为疾病诊断的生物标志物。然而，外泌体的分离技术目前还不够完善，难以得到纯度较高的外泌体，对后续的检测和分析造成了一定的困难；而且外泌体的检测系统也尚未成熟，难以满足临床大样本量的检测。因此，如何在各种体液中检测到疾病特异性的外泌体生物标志物将是今后努力探索的目标之一。总之，外泌体作为疾病诊断的生物标志物仍处于早期研究阶段，要应用于临床诊断还有很长的一段路要走。

外泌体除了有作为生物标志物的巨大潜力外，还为肿瘤的精准治疗提供了新的研究方向。目前，外泌体的应用开始进入不同的临床试验阶段，一些基于外泌体的临床研究方案也已逐步建立。在非小细胞肺癌患者负载自体树突状细胞外泌体的接种试验中，有9例患者已完成疫苗治疗；基于树突状细胞释放的外泌体治疗晚期肿瘤患者的方案安全可行[44]。外泌体在疾病诊断和治疗中的应用前景广阔，但如何实现其在临床上的应用价值仍需研究者们的共同努力。