焦磷酸测序检测分析BRAF基因突变方法的建立

周 钢， 钟 焱

（ 1. 中南大学湘雅医院临床药理研究所，湖南 长沙 410078；2. 长江卫生职业学院，湖南 长沙 410100）

鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1（V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）是人类最重要的原癌基因之一，含18个外显子和17个内含子，定位于染色体7q34，长约190 kb，是一种鸟苷酸结合蛋白活化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞、分裂和分化的有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activiated protein kinese，MAPK）信号通路方面具有重要作用。BRAF基因发生突变后会促进细胞的有丝分裂，导致细胞异常增殖和分化。其突变类型主要有2种：一是位于11号外显子的G463/G465/G468突变，二是位于15号外显子的V600E突变[基因序列的1799位T突变为A或C，导致核苷酸序列第600位的缬氨酸（V）被谷氨酸（E）替代]，其中后者占80%以上。目前临床上的BRAF抑制剂类靶向药物（威罗菲尼、西妥昔单抗、帕尼单抗）对BRAF尤其发生了V600E突变的癌症有很高的活性抑制作用。BRAF基因的突变情况与癌症治疗效果密切相关，YOKOTA等[1]通过研究发现，BRAF基因的突变是晚期及复发性结直肠癌最重要的预后指标之一，与患者的总体生存期密切相关。通过基因检测分析患者癌细胞中该基因的突变情况及突变比例，可指导癌症患者的临床用药，减少患者用药后的副作用，是临床安全、合理用药的重要参考指标。

基于酶级联反应的焦磷酸测序（pyrosequencing，PYRO）技术是新一代DNA序列分析技术，其原理为：测序引物与检测样本的DNA模板退火后，在4种酶（DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶）的共同作用下，将每一个脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleotide triphosphate，dNTP）的聚合与荧光信号的释放偶联起来，通过仪器检测其荧光强度而实时测定DNA序列的每一个碱基，并生成一定的峰值。此方法操作简便、灵敏度高，非常适合已知序列的短片段测序，是单核苷酸多态性、甲基化与肿瘤患者体细胞突变检测的理想检测技术，已逐渐被应用于预防药物不良反应、肿瘤靶向药物用药指导、遗传性疾病诊断等方面并日趋成熟。本研究拟建立快速、简便、高效检测体细胞BRAF基因V600E突变的PYRO方法，并验证该技术的可行性及准确性。

1 材料和方法

1.1 仪器

Qigene pyro24测序仪（德国凯杰公司）、7500 PCR扩增仪（美国ABI公司）等。

1.2 试剂

Purelink Genomic DNA Mini Kit（美国Invitrogen公司），PyroMarkTM Gold Q96 SQA Reagents Kit（德国凯杰公司），PCR amplification kit（大连Takara公司），聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增引物和测序引物由生工生物工程（上海）股份有限公司纯化合成，琼脂糖凝胶电泳核酸染料Gel-Red由碧云天生物技术有限公司提供。

1.3 DNA提取

将收集的100例结直肠癌石蜡包埋组织，按照组织样本基因组DNA试剂盒说明书提取组织样本中的全基因组DNA，用于检测BRAF基因突变。

1.4 PCR扩增

利用PCR引物设计软件Prime 5.0以BRAF第600位密码子上下游序列为DNA模板，设计PCR扩增引物和测序引物，经Blast比对序列分析准确无误后送生工生物工程（上海）股份有限公司纯化和合成，其中下游序列用5'生物素标记（表1）。BRAF基因PCR扩增的体系为：gDNA 2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 1.5 μL，BrafPyro F 0.5 μL，BrafPyorBioR 0.5 μL，rTaq 0.5 μL，无核酶水40 μL。扩增条件为：95 ℃，5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃，5 min；4 ℃保温。所有扩增样本经琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增质量。

表1 BRAF V600E突变PYRO测序PCR扩增引物及测序引物

1.5 PYRO方法的建立

取15～20 μL PCR扩增产物进行PYRO，每孔中加入38 μL结合缓冲液，2 μL生物素-链霉亲和素琼脂糖凝胶微珠，2 000×g震荡混匀，孵育5～10 min。按PYRO操作步骤，经变性及洗涤后，将变性后仅有生物素标记的DNA单链释放到退火缓冲液中，将反应板置于80℃的恒温箱中孵育2 min后，再室温冷却5 min，按照Qigene pyro24测序仪的操作说明设定检测程序，在反应孔中加入PYRO反应所需的酶混合物（E）、荧光底物（S）和dNTP，将反应板放入检测位置进行检测。

1.6 重复性试验和测序验证

任意选取20例结直肠癌组织样本DNA在1周内重复检测3次，对比分析检测结果的一致性。并随机抽取不同突变型的BRAF DNA样本，PCR扩增后进行Sanger测序，验证所建立的PYRO方法的准确性。

2 结果

2.1 PCR扩增产物质量分析

温度对PCR的扩增非常重要，扩增产物的质量会影响PYRO的成败。本研究对BRAF V600E突变的PCR扩增进行了温度梯度实验，同时将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测其质量，将样本的DNA模板进行PCR扩增，得到BRAF V600E突变的PCR扩增产物大小为126 bp PCR产物为120+bp，为BRAF V600E突变的特异性产物，其PCR的最佳扩增温度为56.7 ℃。见图1。

2.2 PYRO结果与重复性验证

对100例样本进行了BRAF V600E突变的PYRO，成功率100%，检出率100%，其中V600E（T＞A）突变样本6例，突变比率为6%。每个样本PCR扩增质量均较高，PYRO的碱基单峰信号值均超过30，碱基检测峰的位置及峰高与待测序列完全相符，多态位点基因型可以清晰判断，见图2。Sanger测序分型结果与PYRO一致，20例样本的2次重复实验结果一致，随机抽样的Sanger测序结果与PYRO分析结果完全相符，见图3。

图1 PCR温度梯度实验琼脂糖凝胶电泳结果

图2 BRAF V600E位点PYRO结果

图3 BRAF V600E位点Sanger测序结果

3 讨论

基于中南大学临床药理研究所临床检测中心的PYRO平台，本研究建立了BRAF基因V600E突变检测的PYRO技术，通过重复性试验和Sanger测序法验证，该方法准确可靠。

随着临床药理遗传学的发展，目前常见的基因突变分析技术很多，大多以PCR技术为基础，主要有直接测序法、扩增阻碍突变系统法、PRYO、转移终止引物延伸法、实时荧光定量PCR、高分辨率通解度曲线法、突变富集液相芯片法等，各种方法均有优势和缺点。PYRO技术是一种全新的核酸序列分析技术，其通过荧光信号种类和强度，可定性或定量检测各种等位基因型，可同时检测96个体系，且每个体系的检测位点不同，具有很大的检测灵活性[2]。与传统的直接测序技术相比，具有通量高、效率高、精读范围大、准确度高、方向多元、可检测低质量样本等优点，可检索已知和未知突变。传统的直接测序法灵敏度较低，检测基因点突变比例的下限为10%左右，而PRYO技术的检测下限可低至5%。此外，直接测序法通过正反双向测序进行比较，PCR扩增产物需先进行分离纯化，检测步骤繁琐、检测周期长、易污染、检测错误概率高。扩增阻碍突变系统法应用也较为广泛，该方法灵敏度高、检测周期短，但需要特殊引物探针，每次仅能检测1种突变，不同的突变必须进行不同的检测，对于突变类型较多的位点（如EGFR19）则不适用，检测成本相对较高。高分辨率通解度曲线法也可检测所有类型的突变，但相对较复杂、操作繁琐。高分辨率通解度曲线法的灵敏高达0.1%[3]，但检测成本远远高于PYRO法，且只能检测已知的突变类型。实时荧光定量PCR的灵敏度较高、检测周期也较短，但其检测成本也高于PYRO技术，只能检测已知的突变类型[4-5]。

BRAF是一种癌基因，编码一种丝氨酸/苏氨酸特异性激酶，是多种信号转导通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种信号通路[6-7]。在多种恶性肿瘤（恶性黑色素瘤、结直肠、肺、甲状腺、肝及胰腺等）中均存在不同比例的BRAF基因突变[8]。易文君等[9]研究发现BRAF基因突变与甲状腺乳头状癌的发生及其淋巴结转移、临床分期相关。朱琰琰等[10]采用PCR扩增和直接测序方法检测我国恶性黑色素瘤患者肿瘤组织中BRAF外显子11和15的突变情况，发现黏膜、肢端和非肢端皮肤黑色素瘤患者BRAF基因的突变率分别为23.3%、16.7%和43.3%。BRAF基因在中国人非肢端皮肤黑色素瘤中突变率较高，且以该基因第15外显子V600E点突变为主[11]。有学者应用荧光PCR-优化寡核苷酸探针法检测304例结直肠癌石蜡包埋样本中BRAF基因的15号外显子的突变情况，发现BRAF基因在结直肠癌的突变率为4.3%，且BRAF基因突变与肿瘤部位、病理类型和分化程度有关[12-13]。BRAF V600E突变指BRAF基因mRNA序列的第1799个核苷酸的碱基T突变为A，导致第600个密码子编码的谷氨酸突变为缬氨酸。此位点突变与昔妥西单抗的低反应率密切相关，BRAF蛋白V600E突变也可以导致对索拉非尼的耐药。由BRAF基因的突变引起的转运能力的改变与药物临床应用及药物不良反应关系密切，因此根据患者遗传背景，进行个体化给药，是保证临床合理、安全用药，避免药物不良反应的有效途径之一[14]。

本研究建立的体细胞BRAF基因V600E突变的PYRO检测方法，通过重复性实验和测序结果验证，其检测准确率为100%，可作为科研或临床中BRAF基因V600E突变检测的一种新的方法。