血三七中岩白菜素的分离鉴定及抗氧化研究

陈翱天，李书华

（1.四川省乐山第一中学校，四川乐山 614000；2.乐山师范学院 化学学院，四川乐山 614000）

血三七是蓼科植物中华抱茎蓼（Polygonum amplexicaule var. sinense）的干燥根茎[1]，具有清热解毒、止痛散瘀和止血的功效，可用于治疗骨折、外伤出血、跌打损伤等[2]，为苗族和土家族常用药。现代药理研究表明，血三七具有抗氧化[3]、抗菌[4]和治疗动脉粥样硬化[5]等多种药理作用。目前，血三七的化学成分研究表明，血三七主要含有黄酮类、蒽醌类及酚酸类化合物[6]，这些化合物分别具有抗氧化[3]、抗病毒[7]、抗菌[8]和镇痛[9]等多种作用。

为了进一步研究血三七的化学成分，以血三七粉末为原料，采用95%乙醇室温浸提，50 ℃减压浓缩后得到无醇水液，用乙酸乙酯除脂后，得到血三七的除脂醇提液。将此除脂醇提液滤膜过滤后，通过制备液相分离，得一单一组分，将该单一组分浓缩后结晶，得到单体化合物。通过核磁共振技术鉴定该单体化合物为岩白菜素，并以维生素C作为阳性对照，采用清除DPPH自由基试验方法研究该化合物的抗氧化活性，探讨了其抗氧化机理，展望岩白菜素作为抗氧化剂在食品领域的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

血三七，购自安徽亳州中药材市场。DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼），购自北京中生瑞泰科技有限公司。维生素C，购自上海源叶生物科技有限公司。RE-301旋转蒸发仪（河南巩义瑞德仪器厂），Waters色谱仪，GeLai制备液相色谱，Varian INOVA 400核磁共振谱仪。

1.2 试验方法

1.2.1 岩白菜素的提取与制备

将2.00 kg干燥的血三七根粉碎，用6 L乙醇（95%）室温浸泡提取72 h，过滤；滤渣再次用6 L乙醇（95%）室温浸泡提取72 h，过滤，合并滤液。在减压及50 ℃条件下浓缩滤液至无醇水液；然后用500 mL乙酸乙酯萃取两次，除去脂溶性成分，得到血三七的除脂醇提液。将该除脂醇提液过滤处理，经中压制备液相色谱仪制备分离，按照各峰收集洗脱液，浓缩各洗脱液至干，甲醇溶解，放置结晶，待晶体析出，过滤，即得到纯品化合物，并以分析液相检测该化合物的纯度。

1.2.2 岩白菜素的结构鉴定

以氘代甲醇为溶剂，用Varian INOVA 400核磁共振谱仪进行核磁测试，解析核磁共振氢谱和碳谱图，得到化合物的结构。

1.2.3 抗氧化性能的测定

根据文献[10]，采用DPPH清除率法，以维生素C为阳性对照，研究纯品化合物岩白菜素的抗氧化活性。

1.2.4 数据分析

抗氧化性能的测定试验中，以维生素C作为阳性对照，以空白为分光光度计调零，做3组重复，抗氧化性能取3组实验的平均值。

2 结果与分析

2.1 岩白菜素的制备

将用2.00 kg干燥的血三七获得的除脂醇提液浓缩至80 mL，加入20 mL甲醇摇匀，配制成100 mL溶液，将该溶液先用普通滤纸过滤，滤液再用0.45 µm的滤膜过滤，得到样品的制备液。将样品的制备液一次性吸入制备液相色谱柱，以乙腈-水为流动相梯度洗脱，运行时间60 min；0 min时，乙腈含量为5%，60 min时，乙腈含量为60%；流速20 mL/min，检测波长275 nm。按照峰收集洗脱液，浓缩各个峰的洗脱液，浓缩干后，用甲醇溶解，放置，结晶，过滤，得到小颗粒状无色晶体，待晶体干燥后称重3.2 g。以分析液相色谱仪检测该化合物纯度为98.5%（检测条件：检测波长275 nm，流速1 mL/min，洗脱液为乙腈-水，设定时间为20 min，0 min时，乙腈比例为5%，20 min时，乙腈比例为40%），如图1所示。

图1 岩白菜素的HPLC纯度

2.2 岩白菜素的鉴定

通过核磁测试得到该化合物的核磁共振氢谱图，如图2所示。从核磁共振氢谱（1H-NMR，CD3OD）可以看出，δ 7.07（1H, s, H-7），δ 4.94（1H,d, J=12 Hz, H-10b），4.07 (1H, d, J=8 Hz, H-4a)，4.03(1H, d, J=8 Hz, H-11)，3.90（3H, s, -OCH3），3.82 (1H,t, J=8 Hz, H-4)，3.70（1H, m, H-11），3.66（1H, m,H-2），3.44（1H, t, J=8 Hz, H-3)。通过核磁测试得到该化合物的核磁共振碳谱图，如图3所示。由核磁共振碳谱（13C-NMR，CD3OD）可以看出，该化合物有14个碳，其化学位移分别为δ 164.3（C-6），150.9（C-8），148.0（C-10），140.8（C-9），118.0（C-6a），115.8（C-10a），109.6（C-7），81.6（C-2），79.9（C-4），74.2（C-4），72.8（C-10），70.4（C-3），61.2（C-11）和59.5（C-12）。综合氢谱和碳谱数据可知该化合物与文献[11]报道的岩白菜素一致，故将该化合物鉴定为岩白菜素，其结构如图4所示。

2.3 岩白菜素的DPPH自由基清除试验结果

岩白菜素和维生素C对DPPH自由基的清除率结果如图5所示。从图5可以看出，岩白菜素、维生素C对DPPH均具有很强的清除作用，化合物浓度越高清除率越大，岩白菜素的抗氧化能力强于阳性对照维生素C。岩白菜素的体系终浓度IC50为0.245 µg/mL，而维生素C的体系终浓度IC50为0.575 µg/mL，从其IC50来看，岩白菜素的抗氧化活性强于比维生素C。

图2 岩白菜素的核磁共振氢谱

图3 岩白菜素的核磁共振碳谱

图4 岩白菜素的结构

图5 岩白菜素对DPPH的清除曲线（n=3）

岩白菜素的抗氧化活性强弱与化合物结构中的酚羟基有关，其可能的抗氧化机理如图6所示。

3 结论

文献报道中华抱茎蓼的生理活性较多，其主要的活性物质为蒽醌、绿原酸等化合物。而本文的实验数据表明，中华抱茎蓼根中岩白菜素含量较高，该化合物具有较强的抗氧化活性，其清除DPPH自由基的体系终浓度IC50为0.245 µg/mL，低于维生素C的体系终浓度（IC500.575 µg/mL），说明岩白菜素的抗氧化活性高于维生素C，预示了富含岩白菜素的中华抱茎蓼还具有抗氧化的新活性，同时岩白菜素的较强抗氧化活性表明其在食品天然抗氧化剂领域和医药保健行业具有潜在的应用价值。

图6 岩白菜素的抗氧化机理