高产淀粉酶菌株诱变筛选及其发酵工艺的研究

桑筱筱，操燕明，杨艾玲，王敬，杜松云

（武汉华夏理工学院 生物与制药工程学院，湖北武汉 430223）

淀粉酶是产量最大、用途最为广泛的一种酶，在动、植物以及微生物中广泛存在[1]。由于工业的发展，社会对该酶的需求日渐增多[2-4]。淀粉酶能催化α-1,4糖苷键水解，并将淀粉分解为多种重要的产物，如单糖分子、糊精等，在生活中的许多方面都有重要的用途，是工业生产中重要的一类酶[5-7]。能获得淀粉酶的途径有很多，可以从动物、植物、微生物中获取，工业生产中微生物是产淀粉酶的重要来源，其应用十分广泛，以其高效的特点著称，几乎已经取代了其他水解淀粉的方法。现代工业利用枯草芽孢杆菌生产淀粉酶已经处在酶制剂行业的首位[7-10]。紫外诱变是进行人工选育高产菌株最常用的方法，其方法操作简便，成本较低，易操作。诱变育种的目的在于选育出具有优良性状的菌株，能满足工业生产的需求，并将其应用于工业生产之中。紫外诱变育种具有随机性和不确定性，因此选育出的菌株所具有的性状具有多样性。在工业生产中要求菌株的遗传稳定性好，相比于自然选育，紫外诱变是一种较优的选择，选育出来的高产菌株能进一步降低生产成本[11]。本研究的意义在于通过诱变筛选出一株高产淀粉酶的菌株，为该酶的工业应用奠定一定的理论基础。同时通过发酵培养基的优化提高产酶活力，筛选出一株高产、高效的菌株，可能会从时间、成本和人力、物力上给工业生产带来巨大的进步。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

从武汉华夏理工学院土样中筛选的枯草芽孢杆菌菌株。

1.1.2 主要试剂及仪器

蛋白胨、可溶性淀粉、牛肉膏、琼脂、NaCl等试剂，购自天津市博迪化工有限公司；碘液、糊精、磷酸氢二钠、柠檬酸等，购自武汉欣申试化工科技有限公司。超净工作台（苏州吴净空调净化有限公司）；台式离心机（SIGMA）；恒温培养箱（SHELLAB）；恒温摇床[伊孚森生物技术（中国）有限公司]；紫外分光光度仪（上海光学仪器厂）。

1.1.3 培养基

淀粉培养基：蛋白胨10 g/L、可溶性淀粉20 g/L、NaCl 5 g/L、牛肉膏5 g/L、琼脂2 g/L，自然pH。淀粉酶发酵培养基：牛肉膏5 g/L、NaCl 10 g/L、蛋白胨5 g/L、自然 pH。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离纯化

从武汉华夏理工学院一食堂附近取土壤样品，把土样放入烧杯加水稀释，将土壤样品稀释成10-3、10-4、10-5的浓度梯度，分别涂布到淀粉培养基上，倒置培养，在27 ℃恒温培养箱中培养2 d。根据枯草芽孢杆菌菌落特点，挑选出符合条件的单个菌落。将单个菌落保存到斜面培养基上，培养2 d后，接种到淀粉培养基上，待菌落长出后用碘液染色进行染色，记录菌落直径和透明圈大小，计算D/d值。

1.2.2 菌种鉴定

产酶菌株的鉴定参照文献[12]，从菌落形态特征、革兰氏染色、芽孢染色生理生化鉴别方面对未知菌种进行初步鉴别。

1.2.3 紫外诱变提高酶活力

本实验采用对比微生物学中麦氏比浊管将菌悬液稀释至104个/mL左右，采用20 W、254 nm、30 cm处紫外灯照射平板，每个平板处理的时间分别为0、2、4、6、8 min和10 min，处理完后，用保鲜膜封口后然后用报纸包好放置在27 ℃恒温培养箱倒置培养2 d，待长出单个菌落后，计数单菌落数，代入公式计算致死率；通过碘液染色处理，分别测量单菌落的淀粉水解透明圈直径以及菌落直径，通过水解透明圈直径和菌落直径的比值（D/d值），选取比值最大的单菌落，接种到斜面培养基上保存。

1.2.4 优化菌株摇瓶发酵条件

按单因素实验研究培养基pH、接种量等因素对菌株产淀粉酶的影响，每种变量3个重复。取平均酶活力值．在最优化各单因素条件下用正交实验选择适宜的液体发酵培养基。实验选取接种量、淀粉含量、蛋白胨含量三因素四水平实验，为减少任务量，经分析查阅资料得到了如下四组处理结果如表1：

表1 正交实验表

保持实验的其他条件不变，按正交实验表中方式处理发酵液，每瓶100mL装至250mL锥形瓶中，编号为1.1、1.2、1.3、1.4，在27℃恒温箱中摇瓶培养48h。最后用分光光度计测定发酵液吸光值。

1.2.5 淀粉酶的初步提纯及酶活性的测定

（1）淀粉酶的初步提纯

为进一步验证上述正交实验所得结果，实验进行粗酶的提取，收集上述中编号为1.1、1.2、1.3、1.4四个锥形瓶中所得发酵液，将其加入离心管中以3000r/min转速进行离心，离心10min后，去除菌体沉淀，收集上清液。在上清液中缓慢加入冰冻乙醇，用玻璃棒轻轻搅拌，加入冰冻乙醇直到终浓度为70%，边搅拌边观察底部有无沉淀析出，于4℃冰箱中盐析，使上清液中蛋白质沉淀，放置过夜，第二天将锥形瓶取出，将溶液放入离心管中以5000r/min转速离心20min，收集沉淀，得到粗酶。

（2） 酶活性的测定

将上述得到的初步提纯的淀粉酶进行酶活性的测定，在1-6号试管中分别加入0%、0.2%、0.5%、1%、1.5%和2.0%的可溶性淀粉稀释液，再向试管中分别各加入1mL缓冲液和1mL蒸馏水，用于标准曲线的制作。将其中编号为1.1′1.2′1.3′1.4′的各管中均加入2.0%的可溶性淀粉，加入1mL缓冲液和1mL正交实验中各种处理结果后所得粗酶液，进行酶活力测定。40℃水浴保温30min，然后加入0.5mol/L乙酸10mL，混匀吸取反应液。之后向反应液中加10 mL碘液，测吸光值。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的菌落特征

该菌落形状呈圆形，颜色为不透明乳白色，边缘较齐整，表面光滑，易挑取，如图1所示。

图1 菌落特征

实验中通过对该菌进行革兰氏染色，用光学显微镜观察，在油镜下发现，细菌被染成紫色，符合革兰氏阳性菌的特征，因此，初步判断筛选得到的菌株为革兰氏阳性菌，如图2所示。将筛选得到的菌株芽孢染色后，在油镜下观察得到该菌体呈红色，芽孢呈蓝绿色，如图3所示，可以初步判断筛选得到的降解淀粉酶的菌为枯草芽孢杆菌。

图2 菌株的革兰氏染色图

图3 菌株的芽孢染色图

2.2 紫外诱变结果

2.2.1 紫外诱变处理

在20 W、254 nm、30 cm处紫外灯下照射平板，随着照射时间的延长，培养基中菌落数逐渐递减，经紫外照射处理后所得的菌落记录如图4所示。

图4 紫外诱变处理结果

2.2.2 计算致死率及制作致死曲线

通过紫外诱变处理，将不同处理时间的菌株涂布平板放置在黑暗条件下培养，以未诱变菌株培养为对照，分别计算致死率，结果如表2所示，致死曲线如图5所示。由致死曲线可以看出紫外线照射对芽孢杆菌的作用效果明显，诱变时间为6 min时，致死率为65.10%，当诱变时间为8 min时，致死率变化基本保持不变在72.40%，为保证较高的筛选概率，选择诱变时间为8 min时候的紫外照射剂量。

表2 致死率计算结果

图5 紫外诱变致死曲线

2.2.3 紫外诱变单菌落D/d值

选取紫外照射为8 min时的菌落，通过碘淀粉显色处理，得到单菌落的透明圈直径和菌落直径及比值，结果见表3。由表3数据可以得到，通过诱变处理后，有的菌株产酶活力有所提高，有的降低，6号菌株的D/d值最大，因此挑选6号菌将其保存到斜面培养基上供后续实验使用。

表3 紫外诱变单菌落D/d值

2.2.4 紫外诱变突变菌株与原始菌株的对比

在相同的接种量和相同的培养基中，菌株培养48h后的突变株与野生菌株透明圈如图6所示。在平板培养基上可以看出，菌落颜色均为乳白色，边缘齐整，表面光滑，菌落大体形状均为圆形。突变菌株与野生菌株较不同的是前者的菌落颜色稍浅于后者，生长周期长，边缘稍有突起，出现透明水解圈所花时间长。但出现的水解圈大小突变菌株明显大于野生菌株。

在斜面培养基上可以看出，突变株菌株松散，生长周期缓慢，而野生菌株菌落结实，生长周期较快。突变菌株与野生菌株D/d值见表4，通过碘淀粉显色处理，突变菌株的D/d值明显高于野生菌株的D/d值，因此，突变菌株的水解淀粉的能力较强。

图6 突变菌株与野生菌株

表4 突变菌株与野生菌株D/d值

2.3 摇瓶培养结果

2.3.1 pH值和装液量对菌株产酶能力的影响

根据所测吸光值显示，当pH为5，装液量为30%时，所测吸光值为0.276最大，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，表明在该条件下酶活性最强，由此确定实验室摇瓶培养的最佳条件：pH为7，装液量为40%，结果见表5。

表5 pH值和装液量对产酶的影响

2.3.2 碳源种类对菌株产酶能力的影响

由表6可知，当碳源为葡萄糖时，其吸光值为1.375最大，表明在该条件下菌株活力最强。

表6 碳源种类对产酶的影响

2.4 正交实验结果

由表7正交实验所测吸光值可得，编号为1.1的所测吸光值最大，表明在该条件下酶活性最强，由此确定实验室摇瓶培养最佳结果为编号1.1处理。

表7 正交实验所测吸光值

2.4.1 标准曲线制作及酶活性测定结果

通过分光光度计测量得到表8数据：

表8 酶活性测定

由表8前6组数据绘制酶活性曲线，如图7所示。

图7 淀粉标准曲线

正交实验酶活力的测定结果见表9。

表9 正交实验酶活力测定

由表9数据可得，1.1号试管的酶活力最强，得到最佳配方为接种量3%、淀粉含量5 g/L、蛋白胨含量5 g/L。

2.5 诱变菌株与野生菌株酶活力的对比

野生菌株所测吸光值A660为1.220，经计算可得其酶活力为8.28 mg/mL·h，诱变菌株酶活力为10.24 mg/mL·h，结果可知经紫外诱变和培养基配方的优化，酶活力提高了1.96 mg/mL·h，产酶活性比出发菌株高出23.7%。

3 讨论

目前对淀粉酶筛选有许多方法，最常用的方法有通过碘液染色法，在淀粉培养基上通过透明圈的大小和菌落直径，确定D/d值，从中筛选出水解淀粉的菌株。但碘液染色法应用于淀粉酶生产菌的筛选具有一定的局限，根据淀粉水解圈的大小来判断菌株产酶活力的高低，有时也不一定完全对应。因此，此方法只能用在初筛产淀粉菌株的筛选中。酶活力的大小的测定不能简单通过透明水解圈的大小来进行判断，应通过更为准确的方法获得。原因有可能是培养平板得透明圈是固体状态，而酶活则是在液体状态下测定，因此，产酶菌株在固态和液态两种状态下反应结果会有所不同。

在土壤中存在不同的产淀粉酶菌株，但产酶活力较低，因此，众多科研工作者在提高产酶活力方面做了许多研究。一般采用传统的诱变方法来提高酶活，比如加化学诱变剂或物理诱变等方法。产淀粉酶菌株多数将酶分泌到细胞外，但也有一些是分泌到细胞内，对于胞外酶一般采用化学、物理或酶降解法去除细胞壁，释放出细胞内酶，进而提高酶活力。本试验中筛选得到的淀粉酶其酶活性仅提高了23.7%，幅度还不够大，因此，有待于通过基因工程技术对菌株进行改造以提高酶活力。