梨树根际枯草芽孢杆菌发酵生产磷酸酶的初步研究

茅燕勇，陈大兵，潘星，李文谦

（1.淮阴工学院，江苏淮安223003；2.淮安市三商农业科技有限公司，江苏淮安 223300）

随着经济的发展，资源匮乏的问题愈发严重。我国有74%耕地土壤缺磷，难溶性磷酸盐不能被植物直接利用，占土壤磷酸盐总量的95%～99%[1-2]。虽然磷肥在农业中已经有较长时间的应用，但磷源供应不足已成为农业生产的重要限制因素，提高土壤磷的利用是解决磷资源匮乏的有效方法，而通过解磷微生物的高效解磷是关键[3-4]。然而，由于微生物解磷机制复杂，解磷微生物肥料在该领域的作用并不明显。

与此同时，当代农业污染已经成为环境污染的主要方面[5]。农业生产中大量排放的氮素、磷素等物质通过地表径流和渗漏是造成农业面源污染的主要原因，而且土壤中存在大量的磷元素因无法被植物吸收利用而造成环境污染。目前，大多数研究者通过大田试验或模拟试验来预测污染，科学指导农民施肥来缓解磷污染[6]。利用解磷微生物制成的肥料或菌剂直接施入土壤，在磷酸酶的作用下，难溶性有机大分子磷分解为小分子的无机磷，植物可以高效利用磷资源，不但减少了农业生产中磷素的过量投入，而且可以将土壤中难溶性的磷溶解供植物吸收利用，在一定程度上减少了农业磷污染[7-8]。在磷素吸收过程中磷酸酶发挥着重要作用[9]。本文对筛选于淮安市三商农业科技有限公司梨树根际土壤的解磷菌发酵产磷酸酶的条件进行初步研究，以期为解磷菌制剂在果园土壤中的施用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌，为实验室筛选于淮安市三商农业科技有限公司梨树根际土壤的菌株。

1.1.2 培养基

LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加入去离子水定容至1000mL，pH 7.0。

发酵培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.3g，七水合硫酸亚铁0.03g，一水合硫酸锰0.03g，磷酸二氢钾2g，加去离子水定容至1000mL，pH 7.0～7.5。

1.2 方法

1.2.1 碳源种类与磷酸酶活性的关系

分别配制含不同碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、糊精、淀粉）的发酵培养基，将活化的枯草芽孢杆菌按10%的接种量接种，28℃，180r/min摇床培养24h。24h后检测发酵液的吸光度值（600nm）、离心后上清液酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性。

1.2.2 氮源种类与磷酸酶活性的关系

分别配制含不同氮源（硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、胰蛋白胨、磷酸氢二铵）的发酵培养基，将枯草芽孢杆菌种子液按10%的接种量接种，28℃，180r/min摇床培养24h。24h后检测发酵液的吸光度值（600nm）、离心后上清液酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性。

1.2.3 磷酸盐种类与磷酸酶活性的关系

配制含不同磷酸盐（磷酸铁、大豆卵磷脂、磷酸钙、植酸钙、磷酸二氢钾）的发酵培养基，按10%的接种量接种枯草芽孢杆菌，28℃，180r/min摇床培养24h。24h后检测发酵液的吸光度值（600nm）、离心后上清液酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性。

1.2.4 无机盐离子浓度（Fe2+、Mg2+、Mn2+）与磷酸酶活性的关系

配制FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O含量分别为0.01g/L、0.03g/L、0.05g/L、0.07g/L、0.09g/L的培养基，以及MgSO4·7H2O含量分别为0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L、0.7g/L、0.9g/L的培养基，按10%的接种量接种枯草芽孢杆菌，28℃，180r/min摇床培养24h。检测发酵液的吸光度值（600nm）、离心后上清液酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性。

1.2.5 磷酸酶活性测定

将发酵液离心取上清，加入4mLMUB（检测酸性磷酸酶时所用MUB试剂pH值为6.5，碱性磷酸酶时所用MUB试剂pH值为11），再加用相同缓冲液配制成的1 mL对硝基苯磷酸二钠溶液，振荡几秒钟，塞住瓶塞，37℃培养1h。培养后，加入lmL 0.5mol/L的氯化钙和4mL 0.5mol/L氢氧化钠，振荡后用折叠滤纸过滤悬液，将澄清滤液在420nm比色。吸取标准对硝基酚溶液 0、l、2、3、4、5ml并定容至 5ml。加入1mL的0.5mol/L的氯化钙溶液和4mL的0.5mol/L氢氧化钠溶液,420nm比色。标准曲线的回归方程及R2值：Y=0.6688X-0.0008 (R2=0.9997)。以每小时1L发酵液中作用于底物并释放出产物的微摩尔数称为1个酶活力单位，记为μmol/(L·h)[10]，通过上述回归方程计算得磷酸酶活力。

2 结果与分析

2.1 碳源种类与磷酸酶活性的关系

碳源分为快速利用和缓慢利用的碳源。选择不同种类的碳源培养枯草芽孢杆菌，发酵液中的磷酸酶活性如图1所示。由图1可知，在以快速利用的葡萄糖为碳源的培养基中，枯草芽孢杆菌产生的磷酸酶活性较高；在以缓慢利用的糊精和淀粉为碳源的培养基中，枯草芽胞杆菌产生的磷酸酶活性较低，原因是糊精和淀粉较难吸收利用，导致产生的磷酸酶活性较低。

图1 不同碳源培养基条件下的磷酸酶活性

2.2 氮源种类与磷酸酶活性的关系

分别选择有机氮源胰蛋白胨和无机氮源硫酸铵、氯化铵等作为氮源进行枯草芽孢杆菌的培养，结果如图2所示。由图2可知，在不同种类无机氮源的培养基中，枯草芽胞杆菌产生的磷酸酶活性变化不是很大，当以胰蛋白胨培养时，枯草芽孢杆菌产生的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性都较高，可能胰蛋白胨是有机氮源，含有较多能够提高磷酸酶活性的微量元素或有益离子。

图2 添加不同氮源培养后产生的磷酸酶活性

2.3 磷酸盐种类与磷酸酶活性的关系

分别选择无机和有机磷源培养枯草芽孢杆菌，结果如图3所示。由图3可知，当培养基中的磷酸盐为植酸钙和磷酸二氢钾时，产生的酸性和碱性磷酸酶活性都较高，且含菌量较高，因此，溶磷效果较高；培养基中添加磷酸铁后，枯草芽孢杆菌产生的磷酸酶活性都较低，可能磷酸铁对枯草芽孢杆菌有毒性效果，影响了菌株正常生长，或其对磷酸酶活性有抑制作用，导致磷酸酶活性较低。

图3 添加不同磷酸盐培养后产生的磷酸酶活性

2.4 Fe2+离子对磷酸酶活性的影响

不同Fe2+离子浓度条件下的酸性和碱性磷酸酶活力如图4所示。由图4可知，当培养基中Fe2+的含量在0.01～0.05g/L时，菌株产生的磷酸酶活性随着培养基中Fe2+含量的增加而提高，当培养基中Fe2+的含量在0.05g/L时，菌体生长最好，枯草芽孢杆菌产生的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性最高，酸性磷酸酶活性最高达到436.2μmol/(L·h)，碱性磷酸酶活性最高达到376.4μmol/(L·h)；随着培养基中Fe2+的含量的继续增加，菌体的量开始减少，产生的磷酸酶活性也开始降低。

图4 添加不同浓度Fe2+产生的磷酸酶活性

2.5 Mg2+离子对磷酸酶活性的影响

由图5可知，在含有不同浓度Mg2+的培养基中，枯草芽孢杆菌产生的酸性磷酸酶活性变化不是很大，当Mg2+含量的为0.7g/L时，酸性磷酸酶活性最高，达到239.6μmol/(L·h)，碱性磷酸酶活性最高达182.8μmol/(L·h)。

图5 添加不同浓度Mg2+产生的磷酸酶活性

2.6 Mn2+离子对磷酸酶活性的影响

添加不同浓度的Mn2+进行枯草芽孢杆菌的培养，测定其酸性和碱性磷酸酶活性结果如图6所示。由图6可以看出，在含有不同浓度Mn2+的培养基中，枯草芽孢杆菌产生的磷酸酶活性较低。在Mn2+的含量为0.07g/L时，枯草芽孢杆菌产生的碱性磷酸酶活性最高，达到115.6μmol/(L·h)。

图6 添加不同浓度Mn2+产生的磷酸酶活性

3 结论

本文对枯草芽孢杆菌发酵产磷酸酶的条件进行了研究，在以葡萄糖为碳源、胰蛋白胨为氮源、Fe2+、Mg2+和Mn2+的浓度分别为0.05g/L、0.7g/L、0.07g/L的条件下，枯草芽孢杆菌产生磷酸酶活性最高，其中酸性磷酸酶活性最高达436.2μmol/(L·h)，碱性磷酸酶活性最高达376.4μmol/(L·h)。