表达禽流感病毒NP和M2融合基因重组乳酸菌的构建及鉴定

李琼燕，杨桂连，张成赛，赵金辉，晋玉北，杨文涛，王春凤

(吉林农业大学动物科学技术学院 吉林省动物微生态制剂工程研究中心，长春 130118)

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的疾病，无论是高致病性禽流感还是低致病性禽流感都需得到重视[1-2]，因为禽流感除了感染禽类，也能感染人、猪、犬等哺乳动物，甚至引起人类的死亡，被我国农业部列为甲类检测传染病[3]。禽流感对于禽类的影响包括上呼吸道感染、产蛋量和体重下降、精神沉郁，严重可导致死亡。禽流感疫病的传播不仅严重损害我国养禽业的发展，同时危害到了人类的健康[2,4]。

流感病毒基质蛋白2(matrix protein2，M2)是存在于流感病毒表面的含量很少的跨膜蛋白之一，但其在被流感病毒感染的细胞表面大量存在[5]。它具离子通道功能，由胞外区、跨膜区和胞内区共同构成跨膜结构[6]。此外，M2蛋白在自1918年大流感爆发至今的各流行株中几乎没有出现变异，在各亚型间高度保守[5]。基于以上特点，M2蛋白成为流感通用疫苗的重要研究成分之一。

乳酸菌作为对机体有益的益生菌，拥有安全性高，容易培养的优点，是禽流感口服疫苗的理想载体[2]。乳酸杆菌是一种乳酸菌，保护性抗原基因或免疫调节因子良好的转化或表达系统，可用作表达内源或外源蛋白的载体，在食品、保健、医疗等多种领域具有广阔的前景[7]。植物乳杆菌(Lb.plantarumNC8)是从青储饲料中分离的一种乳酸菌，与动物源的乳酸菌相比，它的抗逆性更强，适合作为宿主菌表达外源蛋白[2,8]。

本实验旨在将AIV中的M2基因与载体pSIP409-pgsA′-NP连接构建重组质粒，然后制备重组乳酸菌，验证其反应原性。

1 材料与方法

1.1 载体和菌株及主要试剂 质粒pSIP409-pgsA′-NP和pMD19-T-M2由吉林农业大学动物微生态研究室构建保存；Lb.plantarumNC8由印度卡马拉杰大学Anbazhagan.K高级研究员惠赠；PCR反应试剂、无缝克隆试剂盒购自中美泰和生物技术(北京)有限公司、限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ、碱性磷酸酶和核酸分子量标准均购自Takara公司；凝胶回收及PCR产物纯化试剂盒为美国OMEGA公司产品；PVDF转移膜为Gleman公司产品；兔源H9N2亚型禽流感核蛋白NP单克隆抗体购自长春佳博新生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自长春鼎国生物技术公司；分子生物学实验所用其他常用试剂均为进口或国产分析纯产品。

1.2 引物的设计与合成 根据GenBank上登录的M2基因序列，利用Primer5.0软件设计一对引物，并在下游引物加入HindⅢ酶切位点。引物序列如下：P1：5'-TGAAGAATATGATAATGGTAGTGGTGGCGGTG-3'；P2：5'-CTGTAATTTGAAGCTTTCATTCCAATTCAATA-3'。上述引物送至吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.3 目的基因M2的扩增与回收纯化 用pMD19-T-M2质粒为模版，以P1和P2为引物，PCR扩增M2基因。反应体系为10×ExTaq缓冲液2.5 μL，dNTP混合物2.5 μL，上下游引物各1.0 μL，pMD19-T-M2质粒1.0 μL，ExTaqDNA聚合酶0.5 μL，去离子水16.5 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30个循环；最后72 ℃延伸7 min。取1 μL PCR产物加入到8 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。并按照DNA凝胶回收试剂盒操作说明书回收纯化M2基因。

1.4 重组质粒的构建及鉴定 将纯化回收的目的基因M2通过无缝克隆技术与载体pSIP409-pgsA′-NP进行连接，线性化载体pSIP409-pgsA′-NP由限制性核酸内切酶HindⅢ单酶切得到，此外，在NP基因与pSIP409-pgsA′相连接处包含XbaⅠ酶切位点。在离心管中加入线性化载体50 ng，3倍摩尔比于载体的目的基因，5 μL 2×Seamless Master Mix，ddH2O补到10 μL。混匀后在50 ℃反应15 min，然后将离心管放置于冰上。连接产物全量转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，涂布于含200 μg/mL EM的LB琼脂平板上，37 ℃培养12 h。挑取单个菌落至5 mL含200 μg/mL EM的液体LB中，37 ℃培养12 h。培养后的菌液用质粒小提试剂盒提取质粒，各取2 μL质粒用凝胶电泳验证。将有条带的质粒进行XbaⅠ和HindⅢ双酶切验证。将阳性重组质粒送往吉林省库美生物科技有限公司进行测序。序列测定后应用NCBI上的Blast进行比较分析，将测序后的阳性质粒命名为pSIP409-pgsA′-NP-M2。

1.5 重组乳酸菌的制备 将Lb.plantarumNC8在MRS液体培养基中培养过夜，以1∶50的接种量转移到MRS液体培养基中(含有20 g/L甘氨酸)，当OD600值至0.3时离心收集菌液并制备Lb.plantarumNC8感受态细胞。取5 μL重组质粒pSIP409-pgsA′-NP-M2与200 μL冰冷的乳酸菌感受态细胞混合，随后移入到预冷的0.2 cm电击杯中，置于冰上静止5 min后电转化。电转条件为2000 V，400 Ω，25 μF。点击结束后将电击杯中的液体吸入到离心管中，同时加入600 μL 30 ℃预热的含蔗糖的MRS恢复性液体培养基，30 ℃厌氧培养3 h。取100 μL菌液，涂布于含10 μg/mL EM的MRS琼脂平板，30 ℃厌氧培养直到有单菌落出现为止。将疑似阳性菌落挑至含10 μg/mL EM的MRS液体培养基中30 ℃厌氧培养。以菌液为模板进行PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌命名为NC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2。

1.6 重组乳酸菌诱导表达 将重组菌Lb.plantarumNC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2与NC8-pSIP409-pgsA′接到含红霉素的MRS液体培养基中，30 ℃，厌氧条件下培养约12 h，按照1∶50体积接于新鲜的含红霉素的MRS液体培养基中，30 ℃厌氧条件下培养至OD600值为0.3时加入SppIP(终浓度50 ng/mL)诱导培养，30 ℃厌氧条件下培养8 h停止。

1.7 流式细胞术 取200 μL诱导表达后的菌液离心收集菌体，加入100 μL含10 g/L血清的PBS，室温孵育30 min后离心弃上清。以1∶40稀释的兔源H9N2亚型禽流感核蛋白NP单克隆抗体为一抗，室温孵育1 h后用PBS洗2次。以1∶100倍稀释的山羊抗兔FITC为二抗，摇床室温避光孵育1 h，用PBS洗2次后用350 μL PBS悬起。用流式细胞仪检测，FlowJo 7.6软件分析。

1.8 免疫荧光 取上述菌液3 μL菌悬液滴加在载玻片中央，盖上盖玻片置于倒置荧光显微镜下观察。

1.9 Western blot检测 取5 mL菌液离心收集重组乳酸菌菌体，用PBS洗涤两次，超声破碎10 min后离心弃上清，最后悬在160 μL PBS中，加入40 μL 5×SDS上样缓冲液煮沸5 min，-20 ℃保存用于SDS-PAGE和Western blotting检测。用10%SDS-PAGE凝胶进行电泳并按照《分子实验克隆实验指南》进行蛋白转印。转印后PVDF膜用50 g/L的脱脂奶粉常温摇床封闭1 h，以1∶500稀释的兔源H9N2型AIV NP单克隆抗体作为一抗，以1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为二抗，最后用ECL显色试剂盒显色。

2 结 果

2.1 载体片段的确定 将质粒pSIP409-pgsA′-NP通过酶切得到线性化载体，经8 g/L琼脂糖凝胶电泳分析回收所得载体的条带大约在7500 bp处观察可得，与预期大小相符。

2.2 目的基因M2的扩增 以pMD19-T-M2为模版，用所设计的引物进行PCR扩增，经8 g/L琼脂糖凝胶电泳分析结果显示PCR扩增产物的条带大约在300 bp处，与预期大小相符。

M:DNA分子质量标准；1：酶切产物M：DL10000 DNA Marker；1：Product of Restriction enzyme digestion图1 载体pSIP409-pgsA′-NP凝胶电泳结果Fig 1 Results of carrier pSIP409-pgsA′-NP by gel electrophoresis

M：DNA分子质量标准；1:PCR扩增产物M: DL2000 DNA Marker ;1:Amplification products by PCR图2 M2基因的PCR扩增结果Fig 2 Result of M2 gene by PCR

2.3 原核表达载体pSIP409-pgsA′-NP-M2的酶切鉴定 将载体与目的基因分别纯化后通过无缝克隆的方法构建重组质粒pSIP409-pgsA′-NP-M2(图3)。用XbaⅠ和HindⅢ将重组质粒进行双酶切，经8 g/L琼脂糖凝胶电泳分析结果可观察到约6000 bp的pSIP409-pgsA′条带与1800 bp的NP-M2基因条带(图4)，序列分析结果显示与M2基因序列一致，说明目的基因已成功克隆于表达载体中。

M:DNA分子质量标准；1：重组质粒M: DL10000 DNA Marker; 1: Recombinant plasmid图3 重组质粒pSIP409-pgsA′-NP-M2Fig 3 Enzymatic identification of recombinant plasmid pSIP409-pgsA′-NP-M2

M：DNA分子质量标准;1、2；重组质粒酶切鉴定M: DL10000 DNA Marker ;1,2: Enzymatic identification of recombinant plasmid图4 重组质粒pSIP409-pgsA′-NP-M2的酶切鉴定Fig 4 Enzymatic identification of recombinant plasmid pSIP409-pgsA′-NP-M2

2.4 重组菌NC8-pSIP409-pgsA′-M2的PCR验证

将重组质粒通过电转化法转入Lb.plantarumNC8感受态细胞中，将疑似阳性重组菌NC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2进行PCR鉴定，在300 bp处观察到条带，与预期大小一致(图5)。此外，序列分析结果显示与M2基因序列一致，证明重组质粒成功转化入Lb.plantarumNC8中。

M：DNA分子质量标准(10000Marker)；1：阴性对照；2：NC8- pSIP409-pgsA′-NP-M2M : DL10000 DNA Marker ; 1 : Negative control ;2 : NC8- pSIP409-pgsA′-NP-M2;图5 重组乳酸菌的PCR鉴定Fig 5 Identification of recombinant lactic acid bacteria by PCR

2.5 重组乳酸菌的流式细胞术鉴定 用1.6所述方法对重组乳酸菌进行诱导表达，以兔源H9N2亚型禽流感核蛋白NP单克隆抗体为一抗，FITC标记的山羊抗兔IgG为二抗孵育诱导表达后的重组菌。以免疫H9N2亚型禽流感蛋白M2的小鼠血清为一抗，FITC标记的山羊抗鼠IgG为二抗孵育。用流式细胞仪检测，FlowJo 7.6软件分析。图6结果显示，重组乳酸菌锚定表达了目的蛋白，而转入空载体的乳酸菌未检测到目的蛋白。

2.6 免疫荧光验证 上述菌液在荧光显微镜下观察可见重组乳酸菌发绿色荧光，而转入空载体的乳酸菌不发荧光(图7)，提示重组乳酸菌锚定表达了目的蛋白。

图6 重组乳酸菌流式细胞术检测Fig 6 Detection of recombinant lactic acid bacteria by flow cytometry

图7 重组乳酸菌免疫荧光鉴定Fig 7 Detection of recombinant bacteria by immunofluorescence experiments

2.7 Western-blot分析 用10%SDS-PAGE凝胶电泳产物进行蛋白印迹鉴定，在91.6 kD大小处出现一条蛋白印迹(图8)，大小与预期相符，说明重组乳酸菌NC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2表达的外源蛋白具有反应原性。

M：蛋白质分子质量标准；1：空载体表达产物；2: NP-M2基因在乳酸菌中诱导8 h的表达产物M: Protein molecular weight Marker；1：Expression product of pSIP409;2：Expression product of NP-M2 in Lb.plantarum NC8 for 8 h图8 重组乳酸菌的Western-blot分析Fig 8 Western-blot analysis of recombinant gene NP-M2

3 讨 论

H9N2亚型禽流感四季皆可流行，其传播途径很广泛[9]。我国控制H9N2亚型AIV的传播主要依靠灭活疫苗免疫，但研究显示，使用AIV灭活苗免疫的鸡群仍然发生H9N2亚型AIV的感染，并且感染病例呈现增加趋势[10]。这一现象提示H9N2亚型AIV疫苗不能给鸡群提供完全而有效的保护力[11]，研制新型有效疫苗以防控H9N2的传播势在必行。

目前商品化甲型流感疫苗，主要是以病毒表面的血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(neuraminidase, NA)作为抗原成分[12]。但HA和NA易发生抗原漂移,而且甲型流感病毒亚型很多，各亚型病毒间不一定产生交叉保护作用，这给甲型流感的防制带来极大的困难。AIV核蛋白NP在病毒中的蛋白质含量最高[13]，其存在于病毒体的内部，在基因转移和变异方面也比较稳定。此外，研究表明基于M2抗原研制的疫苗免疫可产生抗体，引起特异性免疫[14]。NP和M2抗原序列保守，在不同亚型流感之间也具有较高的同源性，用以研究通用流感疫苗具有良好的前景。本实验制备了融合表达AIV保守抗原NP和M2的重组乳酸菌，旨在研制预防AIV的广谱型制剂。已经报道的数据显示，NP-M2组合基因疫苗产生的保护作用远比使用单基因疫苗效果好[15]，进一步研究发现，NP-M2e重组蛋白联合佐剂通过肌肉注射能使机体产生细胞免疫和体液免疫[16]，但通过注射途径免疫不仅费时费力，而且会使动物产生应激反应。然而，重组乳酸菌作为一种能够通过口服途径给药的新型疫苗不仅具有安全、经济、方便和无应激反应的优势，还可以诱导粘膜免疫反应，更加有利于预防经呼吸道感染的病原体。

近年来，许多研究利用植物乳杆菌作为外源蛋白运载系统研制口服疫苗，但其表达的蛋白多分泌于胞内，在细胞壁的阻隔下会影响免疫效果。锚定基因pgsA来自于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，能将外源蛋白锚定在宿主菌表面[17]，该研究发现，与植物杆菌细胞内表达相比，外源蛋白展示在宿主菌表面能产生更强的免疫效果。本实验利用截断的锚定基因pgsA′将外源蛋白展示在宿主菌表面，通过流式细胞术和免疫荧光技术都已经证实外源蛋白可以展示宿主菌表面，这为下一步评价该重组乳酸菌的免疫效果奠定了重要基础。