高效液相色谱法测定蒲地蓝消炎颗粒中黄芩苷的含量

朱育红，潘康锁，林 涛，苏 敏，晏永新，杨彦平

(1.陕西省兽药监测所，西安710016；2.西安雨田农业科技有限公司，西安710075；3.西安国联质量检测技术股份有限公司，西安?倓710105；4.江西新世纪民星动物保健品有限公司，南昌330096)

蒲地蓝消炎颗粒是运用中兽医传统理论，在中华人民共和国卫生部《部颁标准》第三册所载“蒲地蓝消炎片”的基础上研制的中兽药三类新药。处方由黄芩、蒲公英、板蓝根和苦地丁四味药材组成。该药是采用提取精制的方法制成的中药颗粒剂，具有清热解毒，抗炎消肿之效，用于鸡传染性支气管炎诱发的咳喘证。收载在中华人民共和国卫生部《部颁标准》第三册的蒲地蓝消炎片原标准无含量测定方法。为更好的控制蒲地蓝消炎颗粒的质量，参考文献方法，研究建立了采用反相高效液相法测定蒲地蓝消炎颗粒中黄芩苷的含量测定方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC20高效液相色谱仪；安捷伦1100型高效液相色谱仪；色谱柱Kromasil 100-5-C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm)；电子天平(型号BP211D)购自德国塞托里斯公司。

1.2 试药与试剂 黄芩苷对照品(批号为110715-201117，标识含量为91.7%)来源于中国食品药品检定研究院；蒲地蓝消炎颗粒样品(每1 g相当于原生药1.5 g)三批，批号分别20120203、20120204、20120205，来源于江西新世纪民星动物保健品有限公司；甲醇为色谱醇，天津市科密欧化学试剂有限公司生产；水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 流动相：甲醇-0.3%磷酸溶液(45∶55)；流速：1.0 mL/min；检测波长280 nm；柱温：室温；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇少许使溶解，加50%甲醇稀释，制成每1 mL含0.25 mg的黄芩苷对照品贮备液(实际浓度为0.252 mg/mL)，精密量取黄芩苷对照品贮备液5 mL，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液稀释至刻度(实际浓度为50.4 μg/mL)，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取蒲地蓝消炎颗粒适量，研细，取细粉约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇100 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)20 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方及制法制备不含黄芩的阴性制剂，取黄芩阴性制剂，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

2.3 系统适用性和专属性试验 精密量取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按2.1项色谱条件测定，结果理论塔板数以黄芩苷峰计算为7016，供试品色谱图中黄芩苷峰与临峰分离良好，分离度为3.92，阴性对照色谱在与对照品色谱相同保留时间处无干扰峰(图1)。结果表明，系统适用性可以满足检测要求；处方中其他成分对黄芩定量检测无干扰，专属性能满足检测要求。

(A:Radix scutellariae;B: Pudilan Anti-inflammatory Granule;C: Scutellariae Radix negative control)图1 专属性试验色谱图(A、B、C分别为黄芩苷、蒲地蓝消炎颗粒供试品、黄芩阴性对照)Fig 1 HPLC chromatograms of specific test

2.4 线性关系考察 取黄芩苷对照品贮备液(浓度0.252 mg/mL)，分别精密吸取1、2、5、10、15 mL，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，按上述色谱条件，分别进样10 μL，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，以进样浓度为横坐标(X)，进行线性回归，得回归方程y=39.396x-2.1797，R2=0.9999(n=5)，黄芩苷在10.08～151.2 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 准确度 采用加标回收的方法，在已知含量的蒲地蓝消炎颗粒中，加入一定质量的黄芩苷对照品，按供试品溶液制备方法制备，使其制备后在供试品中的量为其限度值的100%，共制备6份。再按2.1项色谱条件测定峰面积，计算黄芩苷的量，用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量，计算黄芩苷回收率，即得。

回收率R(100%)=(实测量-供试品中含有量)/添加量×100%

测定结果，黄芩苷的回收率在98.4%～101.4%之间，平均回收率为99.8%，RSD为1.03%，结果见表1。

表1 加样回收率试验Tab 1 Recovries of Baicalin in preparation

2.6 精密度 取供试品(批号为20120203)溶液，精密量取10 μL，按2.1色谱条件重复进样6次，测得黄芩苷峰面积RSD为1.19%，结果见表2。

表2 精密度试验Tab 2 Precision test

2.7 耐用性 取同一批蒲地蓝消炎颗粒(批号为20120203)样品，按2.2项下方法制成供试品溶液，保持流动相比例和流速不变，在岛津LC20高效液相色谱仪和Agilent1100色谱仪上分别使用Kromasil 100-5-C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm)柱和Agilent XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 um)色谱柱，于20 ℃，30 ℃，40 ℃条件下进行测试，考察方法的耐用性，结果表明该方法能够耐受不同液相色谱仪，色谱柱，柱温等因素的小范围变化，测得蒲地蓝消炎颗粒中黄芩苷的含量无明显差异，说明耐用性良好，结果见表4。

表4 耐用性试验Tab 4 serviceability test

2.8 稳定性试验 取供试品(批号为20120203)的样品，按2.2项下方法制成供试品溶液，立即测定，再在2、4、6、8 h的时间点进行测定，结果RSD为1.08%，表明测定值在8 h内基本稳定，结果见表3。

表3 稳定性试验Tab 3 Stability test

2.9 样品含量测定 取3批蒲地蓝消炎颗粒(批号分别为20120203、20120204、20120205)分别按2.2项下方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，上机测定峰面积，通过外标法计算黄芩苷的含量，结果见表5。

表5 样品含量测定结果(单位：mg/g)Tab 5 Content determination results (unit：mg/g)

3 讨论与结论

3.1 含量测定成分的选择 蒲地蓝消炎颗粒处方源于中华人民共和国卫生部《部颁标准》第三册“蒲地蓝消炎片”，是由黄芩、蒲公英、板蓝根、苦地丁四味药材提取精制制成的中药颗粒剂，具有清热解毒，抗炎消肿之效，用于鸡传染性支气管炎诱发的咳喘证。黄芩为该制剂的君药，其主要成分为黄芩苷。黄芩苷具有显著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、降胆固醇、抗血栓形成、缓解哮喘、泻火解毒、止血、安胎、抗变态反应及解痉作用，也为哺乳动物肝脏涎酶的特异性抑制剂，具有调节某些疾病的作用，也具有较强的抗癌反应生理效能，故选择黄芩苷作为含量测定成分。采用HPLC测定蒲地蓝消炎颗粒中黄芩苷的含量，操作简便，黄芩苷在10.08～151.2 μg/mL范围内线性关系良好，方法准确度、精密度、日内稳定性和耐用性均能达到检测要求。

3.2 样品前处理方法的选择 黄芩苷是一种黄酮类化合物,具有显著的生物活性。其提取分离方法主要有水浴回流提取法，水提酸沉法、醇提酸沉法、有机溶剂超声法等方法。参考《中华人民共和国兽药典》2015年版二部双黄连口服液含量测定项下前处理方法，本试验采用50%甲醇作为溶剂，超声处理20 min，结果证明该方法能够较为完全地提取出蒲地蓝消炎颗粒中的黄芩苷，并且阴性对照无干扰。

3.3 结论 用高效液相法测定蒲地蓝消炎颗粒中黄芩苷的含量，方法简便，准确，灵敏度高，回收率好，可有效控制该制剂中主药黄芩的含量。