氟苯尼考注射液在鸡体内残留消除研究

宋志超，张崇威，陈 蔷，朱 雷，邱富娜，吴宁鹏，吴志明

(河南省兽药饲料监察所，郑州 450008)

氟苯尼考属动物专用氯霉素类广谱抗菌药物，由美国Schering-Plough公司于1988年研制成功，并在1999年被我国批准为国家二类新兽药[1]。因其吸收好、体内分布广、安全高效，并且无再生障碍性贫血的特点，氟苯尼考被广泛用于治疗猪、禽、牛及水产等养殖动物的细菌性疾病[2-4],但氟苯尼考对哺乳动物具有胚胎毒性，人体用药后还出现厌食、腹泻等不良反应，长期食用含有氟苯尼考及其代谢物的动物源食品将会对人体产生严重的安全隐患[5]。因此，严格控制动物源食品中氟苯尼考残留量、合理制定氟苯尼考休药期就显得尤为重要。

本实验以自制10 mL∶0.5 g氟苯尼考注射液为研究对象，按照《中国兽药典(2015年版)》兽药制剂品种说明书范本中有关氟苯尼考注射液的规定给药，并建立氟苯尼考及氟苯尼考胺的液相色谱-串联质谱检测方法。对各个组织中的氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺进行检测，计算相应休药期，为正确用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 5%氟苯尼考注射液：自制。氟苯尼考对照品：含量99.3%，批号K0301305，中国兽医药品监察所提供；氟苯尼考氘代物对照品：含量98.0%,批号F405751，TRC公司；氟苯尼考胺对照品：含量99.1%，批号262329，Witega公司提供；氟苯尼考氘代物：含量98.0%，批号21-SHG-115-1，TRC公司提供；甲醇、乙腈为色谱纯；氨水25%～28%；乙酸乙酯、无水硫酸铵、甲酸铵、氯化钠、正己烷为分析纯。

1.2 仪器设备 Waters Acquity UPLC-Xevo TQ-S液质联用仪(配电喷雾离子源)；高速冷冻离心机；氮吹仪；分析天平；Milli-Q超纯水仪。

1.3 溶液配制 2%氨化乙酸乙酯：取氨水20 mL，加乙酸乙酯980 mL，混匀；4%氯化钠溶液：取氯化钠4 g，用水溶解并稀释至100 mL；4%氯化钠溶液饱和的正己烷：取一定量4%氯化钠溶液，加入过量的正己烷，混合，静止分层；20%甲醇溶液：取甲醇20 mL，加水80 mL，混匀；10 mmol/L甲酸铵溶液：取甲酸铵0.63 g，用水溶解并稀释至1000 mL。

1.4 试验动物 白羽鸡35只，体重2.5±0.5 kg，购于河南大用实业有限公司。给药组30只，公母各半，对照组5只，公鸡3只，母鸡2只。试验前预饲养1周，期间不给任何抗菌药物，试验前后各组饲养条件相同。

1.5 给药与样本采集 给药组按照20 mg/kg(按氟苯尼考计)，肌内注射，每隔48 h给药1次，连用2次，并于最后一次给药0(6 h)、1、3、5、7 d分别随机宰杀6只(给药组)及1只(空白对照组)，采集胸脯鸡肉(非注射部位)、鸡全肝、鸡全肾、鸡皮脂，做好标记，于-20 ℃保存。

1.6 试验方法 本研究根据具体情况，采用实验室自建残留检测方法对样品进行测定，内标法定量[6]。

1.6.1 样品前处理 称取试样(2±0.02)g，置于50 mL塑料离心管，添加氟苯尼考及氟苯尼考胺混合内标工作液(50 μg/mL)100 μL，加2%乙酸乙酯-氨水溶液10 mL，涡旋混匀，涡旋振荡10 min，8000 r/min离心10 min，取上清液于另一离心管中；残渣用2%乙酸乙酯-氨水溶液10 mL重复提取一次，合并上清液，于50 ℃水浴氮气吹干。

在残留物中加入4%氯化钠溶液3 mL，涡旋使溶解，再加入4%氯化钠溶液饱和的正己烷5 mL，涡旋混合30 s，8000 r/min离心5 min，弃去正己烷，用5 mL 4%氯化钠溶液饱和正己烷重复脱脂一次。在下层水相中加入2%乙酸乙酯-氨水溶液5 mL，涡旋振荡5 min，8000 r/min离心5 min，吸取上层有机相于10 mL离心管中，残渣用2%乙酸乙酯-氨水溶液5 mL重复萃取一次，合并有机相，50 ℃水浴吹干，残渣加入20%甲醇溶液1.0 mL，涡旋混匀，过0.22 μm滤膜供液相色谱-串联质谱测定。

1.6.2 液相色谱参考条件 色谱柱：C18柱，2.1×100 mm，粒径1.7 μm，或相当者；流动相A：乙腈，B：水(氟苯尼考及氟苯尼考氘代物)/10 mmol/L的甲酸铵溶液(氟苯尼考胺及氟苯尼考胺氘代物)，梯度洗脱程序见表1；30 ℃；进样量5 μL。

表1 梯度洗脱条件Tab 1 Procedure of gradient elution

1为即时变化，6为线性变化

1.6.3 质谱参考条件 离子源：电喷雾(ESI)离子源；扫描方式：正离子(氟苯尼考胺及氟苯尼考胺氘代物)，负离子同时扫描(氟苯尼考及氟苯尼考氘代物)；检测方式：多反应离子监测(MRM)；电离电压：负离子模式3.0 kV，正离子模式1.5 kV；锥孔电压：负离子模式20 V，正离子模式8 V；源温：150 ℃；脱溶剂气温度：500 ℃；锥孔气流速：150 L/h；脱溶剂气流速：1000 L/h；定性、定量离子对、离子源、锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2 定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞能量Tab 2 Qualitative and quantitative ion pair，the corresponding cone volt and collision enerey

标“*”为定量离子对

2 结果与分析

2.1 标准曲线 氟苯尼考在0.5～20 μg/L(内标浓度为5 μg/L)浓度范围内、氟苯尼考胺在0.5～50 μg/L(内标浓度为5 μg/L)呈现良好的线性关系，其线性方程分别为：y=1.8691x+1.2865和y=0.8570x+0.0166，相关系数R分别为0.9991和0.9999，如图1及图2。标准溶液和组织中氟苯尼考及氟苯尼考胺色谱图见图3及图4。

2.2 组织中药物残留及消除规律 按照实验室自建方法对所采集各组鸡肉、鸡肝、鸡肾、鸡皮脂中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺进行检测，内标法定量。不同时间点各残留量见表3及表4，残留消除曲线见图5、图6。

图2 氟苯尼考胺标准曲线Fig 2 Standard curve of florfenicol amine

图3 氟苯尼考及氟苯尼考胺混合标准溶液色谱图Fig 3 Chromatogram of mixed standard solution of florfenicol and florfenicol amine

图4 鸡肾中残留的氟苯尼考及氟苯尼考胺色谱图(休药后第0天)Fig 4 Chromatogram of florfenicol and florfenicol amine residues in chicken kidney (day 0 after withdrawal)

2.3 休药期计算 按照农业农村部关于氟苯尼考残留标示物最大残留限量[7]和欧盟对休药期计算的有关规定，用CVMP制定的统计方法(双单侧95%置信区间)，对自制5%氟苯尼考注射液在鸡组织中休药期进行计算。氟苯尼考在各组织中的休药期见表5，残留消除拟合图见图7～图10。

表3 不同时间点氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺在鸡各组织中残留量(μg·kg-1)Tab 3 Residues of florfenicol and its metabolite florfenicol amine in chicken tissues at different time (μg·kg-1)

ND为未检出

表4 停药期间氟苯尼考胺及氟苯尼考在各组织中的残留量Tab 4 Residues of florfenicol amine and florfenicol in various tissues during withdrawal

ND为未检出

图5 肌肉、皮脂中氟苯尼考胺的残留消除曲线Fig 5 Depletion curve of florfenicol amine residue in muscle and sebum

图6 鸡肝、鸡肾中氟苯尼考胺的残留消除曲线Fig 6 Depletion curve of florfenicol amine residue in chicken liver and kidney

组织Tissue 肌肉Muscle肝脏Liver肾脏Kidney皮+脂Sebum休药期/dWithdrawal period3.412.062.251.47

图7 氟苯尼考注射液在鸡肉中残留消除拟合图Fig 7 Fitting diagram of depletion of residue of florfenicol injection in chicken

图8 氟苯尼考注射液在鸡肾中残留消除拟合图Fig 8 Fitting diagram of depletion of residue of florfenicol injection in kidney

图9 氟苯尼考注射液在鸡肝中残留消除拟合图Fig 9 Fitting diagram of depletion of residue of florfenicol injection in liver

图10 氟苯尼考注射液在鸡皮脂中残留消除拟合图Fig 10 Fitting diagram of depletion of residue of florfenicol injection in sebum

如表5、图7～图10所示，根据WT1.4软件计算出氟苯尼考在鸡肉、肝脏、肾脏、皮脂的休药期分别为3.14、2.06、2.25、1.47 d。

3 讨论与结论

3.1 检测方法 目前，氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的检测方法主要有高效液相色谱法[8-10]、气相色谱法[11-12]、气相色谱-质谱联用法[13-14]、液相色谱-串联质谱法[15-16]和酶联免疫法[17]等。由于高效液相色谱灵敏度低，气相色谱、气相色谱-质谱联用法需经衍生化后方能检测，操作繁琐，酶联免疫法准确度低等缺点均无法满足要求，本研究根据实验室具体条件，在碱性环境下使以有机盐形式存在的代谢物以有机分子形式游离出来，并以毒性较小溶解性较好的乙酸乙酯作为提取溶剂，经正己烷脱脂净化，前处理操作简便快捷。采用具有高灵敏度的超高效液相色谱-串联质谱法对氟苯尼考及氟苯尼考胺进行残留检测，同时考虑到基质效应对准确度的影响，因此，采用内标法校正，不但使低残留能被检测到，同时准确度也大大提高，保证了所得残留数据的可靠性。

3.2 检测结果 如表3，图5、图6所示，在停药后第0天(6 h)，鸡肉、肾脏、皮脂中的氟苯尼考胺残留量达到最大值，鸡肉中为(203.5±40.52)μg/kg，鸡肾中为(993.5±190.07)μg/kg，鸡皮脂中为(104.15±14.85)μg/kg。鸡肝中氟苯尼考胺在停药后第1天达到最大值，为(139.18±29.13) μg/kg。鸡肉、肾脏、皮脂中的氟苯尼考胺残留量在停药后均呈下降趋势。停药后第1天各组织中氟苯尼考胺残留量均低于农业部公布的MRL。停药第5天时肌肉中检测不到氟苯尼考胺。可见，在停药后第0天及第1天时，肝脏及肾脏中的氟苯尼考胺残留量明显较高，说明氟苯尼考主要经肝、肾代谢及排泄，在停药后第1天时，肉、肾、皮脂中氟苯尼考胺在鸡各组织中均低于50 μg/kg，可见其代谢迅速，以上两点与丁飞[18]及卢运战[19]报道结果一致。

3.3 休药期 有文献报道[20]，氟苯尼考残留休药期计算以氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量之和为依据，以及给药疗程单剂量20 mg/kg(以氟苯尼考计)连续给药3 d的情况。本研究按照《中国兽药典(2015年版)》兽药制剂品种说明书范本中有关氟苯尼考注射液的给药规定，以及农业部235公告规定的氟苯尼考残留标识物为氟苯尼考胺的规定[7]，故本研究给药量为每次20 mg/kg(以氟苯尼考计)，隔48 h用药1次，连用2次，在计算氟苯尼考休药期时以氟苯尼考胺的残留量为依据。

丁飞[18]以氟苯尼考磺酸盐注射液按照20 mg/kg对鸡进行肌内注射，每天1次，连续给药3 d，给出推荐休药期为5 d。与本实验的以氟苯尼考注射液为研究对象，给药剂量20 mg/kg，肌内注射，每隔48 h给药1次，连用2次所计算出的休药期略有差异，考虑主要是由于给药剂量、剂型不同等原因造成。

按照20 mg/kg(按氟苯尼考计)，肌内注射，每隔48 h给药1次，连用2次，建议休药期为4 d，但考虑到鸡各组织内同时存在氟苯尼考及氟苯尼考胺以及其他有害代谢产物，例如氟苯尼考醇和一些未知代谢物形式[21]，给动物性产品的质量安全带来风险。因此，实际休药期应高于4 d。