金银花纯花固态发酵酒风味特征及活性功能成分分析

马 宇，黄永光,*，唐东亚，潘承金

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州花酒酒业有限公司，贵州 镇远 557700）

金银花又名双花、银花、忍冬花，是我国传统的中药材之一[1]，属于国家重点管理以及国务院确定的名贵药材之一[2]。研究发现金银花中主要含有绿原酸、肌醇、皂贰、挥发油、黄酮类等药理成分，其中以绿原酸的含量最高。大量研究表明绿原酸对心血管有保护作用[3]，对胃癌及结肠癌的发生具有预防及抑制作用[4]，对降血脂[5]、抗炎[6]、抗氧化[7]、调节免疫系统[8]等均有显著效果。以原生态纯花为原料，利用现代发酵调控技术开发花酒产品，不但可以实现对纯天然资源的高效利用，而且也可以将纯花中的活性功能成分进行生物性高效提取，转移到酒类食品中，满足消费者对酒类健康产品的营养与保健功效的消费需求。

花酒的制作方式主要有浸泡、发酵和蒸馏[9-10]，也可多种工艺交互应用[11]，纵观现有的花酒产品类型，以浸泡、浸提工艺生产的花酒居多。浸泡、浸提生产工艺是药酒、花卉酒等功能营养型酒生产采用的一种普遍工艺方法。利用浸泡工艺主要是将花卉中的有效成分和独特香味通过浸提转移到酒中，赋予其养生功效，再经过过滤、澄清得到较为稳定的花酒产品，其工艺原理为醇溶、浸提，花卉中有效成分的提取受浸提媒介、温度、时间等影响，一般提取效率较差，同时还无法实现对甲醇等安全性指标的有效防控[12]。发酵和蒸馏工艺在花酒制作中较少，多采用粮食加鲜花的方式进行花酒的酿造，由于原料上离不开粮食所以酒中甲醇无法避免；其次是酒精加鲜花发酵液方式，该生产方式在一定程度上也会降低鲜花的营养与药理保健成分。纵观现有资料报道，花酒酿造仍然没有一种有效的方法实现对食用花卉中有效活性、风味和营养成分的提取与富集。

本实验主要采用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrum，GC-MS）联用方法对金银花纯花固态发酵酿造花酒的风味进行研究，并测定其活性成分及相应的理化指标，以研究纯化固态发酵酒的特征风味及其风味形成机理、酒体中的主要风味成分对酒体风味风格特征的影响机制，为探索花卉酿造资源的利用和产品开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金银花酒（乙醇体积分数42%）于贵州花酒酒业有限公司2015年7月生产。酿造工艺：采用特制小曲为发酵剂，对纯花固态发酵进行调控，采用1 000 kg大型陶坛为发酵设备，发酵时间30 d，基酒经长期贮存后勾兑而成（酿造技术专利号ZL 201210015038.7）。

正构烷烃混合标准品（C7～C40）、2-辛醇（均为色谱纯） 美国Sigma-Aldrich公司；石油醚、甲醇、芦丁标准品 上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GC 7890-5975 MSD GC-MS联用仪、1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司；2000型蒸发光散射检测器美国Alltech公司；SB2200超声波清洗器 上海超声仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 理化指标的测定

甲醇、氰化物（按氢氰酸计）：GB/T 5009.48—2003《蒸馏酒与配制酒卫生标准的分析方法》；铅：GB 5009.12—2010《食品中铅的测定》第一法；总砷：GB 5009.11—2014《食品中总砷及无机砷的测定》第一法；汞：GB 5009.17—2014 《食品中总汞及有机汞的测定》第一法；锡：GB 5009.16—2014《食品中锡的测定》第一法；山梨酸：GB/T 5009.29—2003《食品中山梨酸、苯甲酸的测定》第二法；亚硫酸盐（以二氧化硫计）：GB/T 5009.34—2003《食品中亚硫酸盐的测定》第一法；乙二胺四乙酸（以乙二胺四乙酸二钠钙计）：SN/T 1018—2001《出口食品罐头中乙二胺四乙酸含量检验方法》；邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯：GB/T 21911—2008《食品中邻苯二甲酸酯的测定》。

1.3.2 感官评定

根据文献[13]方法，选取10 人进行金银花酒整体风味轮廓的感官评定，品评人员包括研究白酒风味化学的8 名研究生和具有10 a以上白酒品评经验的2 名老师（省级评委、国家一级品酒师）。经培训练习后，感官品评人员对金银花酒样品的香气，如花香、甜香（蜂蜜/焦糖）、水果香、发酵香（酒香）、粮香（小麦/麦芽）、草本/青生、曲香和酯香等香气的感官强度进行评定，评定分数范围为0～5，0 分为未闻到，5分为闻到的香气最强。取20 mL酒样于白酒品评专用杯中，于（20±1）℃进行感官评定，取所得分值结果的平均值作风味蜘蛛网图。

1.3.3 风味成分分析

HS-SPME萃取：根据范文来等[14]方法，取2 mL酒样放入15 mL顶空瓶中，加入5 mL去离子水，用NaCl饱和，旋紧瓶盖，超声萃取30 min。将顶空瓶置于水浴中于50 ℃恒温萃取40 min，萃取完毕后将萃取头取出，插入GC进样口热解吸3 min，热解吸温度250 ℃。

GC条件：采用非极性与极性双柱检测定性。GC检测器和进样口温度为250 ℃，进样量为8 mL，不分流进样，氦气作为载气，流量2 mL/min，色谱柱初温50 ℃维持2 min，再以6 ℃/min升温到230 ℃，并控制此温度15 min。

MS条件：电子电离源；离子源温度：230 ℃；电子能量：70 eV；全方位扫描范围：35～350 amu。

1.3.4 活性功能成分测定

绿原酸：参照GB/T 22250—2008《保健食品中绿原酸的测定》，其含量计算见式（1）：

式中：X为酒样中绿原酸质量浓度/（mg/L）；c为标准曲线下求得进样液中绿原酸质量浓度/（μg/L）；V1为溶液定容体积/L；V2为花酒试样的体积/mL。在相同条件下重新测定其结果所得的绝对差值不得超过算数平均值的10%。

芦丁：参考白鸿[15]方法采用高效液相色谱检测金银花酒中的芦丁，计算见式（2）：

式中：X为样品中芦丁质量浓度/（mg/L）；S1为样品峰面积；S2为标准液峰面积；V为样品定容体积/L；m为样品质量/mg；c为标准液质量浓度/（mg/L）。

单宁：参照NY/T 1600—2008《水果蔬菜及其制品中单宁含量的测定 分光光度法》。

1.4 数据及图像处理

定性分析：根据改进的Kovats法[16]计算保留指数（retention index，RI）。在各组分中添加C5～C30烷烃混合标样，进GC-MS分离，通过烷烃的保留时间计算未知物的RI。通过质谱谱库检索与NIST 05 a.L库的标准质谱图比对定性，定性结果通过计算其RI值、香气描述与文献报道RI值和香气描述比对确认，其计算见式（3）：

式中：ti为香气物质i的保留时间/min；tz和tz+1为紧邻香气物质i前后的两个正构烷烃的保留时间/min；z为正构烷烃的碳原子数。

定量分析：采用内标法定量，通过内标物的峰面积和样品中各组分的峰面积比值，计算各个组分质量浓度，其计算见式（4）：

式中：Ci为待测组分i的质量浓度/（mg/L）；Ws为加入内标s的质量/mg；Ai和As分别为待测组分i和内标化合物s的峰面积；V为待测样品的体积/L；fi为待测组分i对内标s的相对质量校正因子；本实验中各待测组分i的相对校正因子均为1。

风味轮廓分析采用Microsoft Excel 2016软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 金银花酒理化指标

表1 金银花酒理化指标检测结果Table 1 Physicochemical properties of honeysuckle flower liquor

由表1可知，从金银花固态发酵酒中均未检出甲醇、氰化物、铅、总砷、汞、锡、山梨酸、亚硫酸盐、乙二胺四乙酸（以乙二胺四乙酸二钠钙计）、邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯，相关理化卫生指标符合国家相关标准规定。

2.2 金银花酒体风味分析

2.2.1 金银花酒中挥发性风味成分分析

图1 金银花酒GC-MS图Fig. 1 GC-MS profile of honeysuckle flower liquor

表2 金银花酒中主要挥发性风味物质成分检出结果Table 2 Main volatile flavor compounds identified in honeysuckle flower liquor

续表2

续表2

对金银花酒的GC-MS图进行定性分析，从金银花酒中定性定量检测鉴定出69 种主要风味化合物（表1），其中，酯类21 种，烃类16 种，芳香类15 种，萜烯类6 种，醇类5 种，醛类2 种，酸类2 种，醚类1 种，呋喃类1 种。

从所定性定量风味化合物来看，花酒中数量最多的是酯类化合物，占全部检出挥发性风味物质的24%，酯类大部分来源于发酵过程中醇与酸的酯化反应。由于酒中乙醇含量较高，通过固态发酵形成较多乙酯，使得乙酯在所生成酯中占了较大比例，其中乙酸乙酯由酵母氨基酸或糖代谢产生的高级醇和乙酰辅酶A反应形成，而脂肪酸乙酯如丙酸乙酯、丁酸乙酯等则是由酵母脂肪酸代谢过程中产生的脂酰辅酶A醇解产生[24]。酯类香气物质主要呈水果香和花香，是花酒中种类最多的香气物质，共检测到21 种。可以应用香气化合物的气味活性值（odour activity value，OAV）判定其是否是酒体中重要香气化合物，通常情况下OAV不小于1的化合物对酒体的整体香气有贡献。香气化合物的OAV越大，说明其对整体香气贡献越大[25]。在酯类中，OAV大于1的有：辛酸乙酯（OAV=1 766），贡献白兰地似的甜香；3-甲基丁酸乙酯（OAV=176），贡献果香、酯香；癸酸乙酯（OAV=58），略有刺激气味；乙酸异戊酯（OAV=56）有愉快香蕉香味；月桂酸乙酯（OAV=26.7），贡献花果香；己酸乙酯（OAV=8.7），贡献菠萝香；辛酸异戊酯（OAV=4.1），贡献水果香，稀释后呈白兰地似酒香。

其次是芳香族化合物，芳香族化合物多数呈花香，增进酒体香浓协调，主要来源于原料中芳香族氨基酸的分解代谢，是金银花酒中的重要香气物质。在金银花酒中共检测到芳香族化合物16 种，占18%，芳香族化合物以苯乙醇（OAV=94.25）为主，贡献了金银花酒青草香、玫瑰花香、花粉香等典型的香气。

再次是醇类化合物，占比为5%～9%。醇类物质种类数量虽少，但整体浓度高，醇类物质主要来自发酵阶段有氧环境下糖类的转化和无氧条件下氨基酸的转化，少量的高级醇可通过酵母还原相应的醛类物质生成[26]。除乙醇外，2-甲基丁醇（OAV=3.5）是金银花酒中最重要的醇类物质，呈葡萄酒香及醇香。

花酒中的乙缩醛是重要的香气化合物（OAV=301.8），为乙醛与乙醇的缩合物。据资料报道，乙缩醛也是清香型白酒最主要的缩醛类物质[27]，这是缘于金银花酒采用了类似小曲清香型白酒的酿造工艺。乙醛具有较强的刺激性口味，单体乙醛在白酒中呈新酒味，加入清香型白酒后呈类似青草的香气，有刺激感，随着贮存时间延长，新酒味和刺激感逐渐消失而变得柔和。乙缩醛具有柔和爽口的口感特征，如与乙醛的量比关系适宜，能增加酒的放香和消除酒体的沉闷感[28]。

萜烯类物质为饮料酒中一类重要的功能活性物质，大多数关于酒中萜烯类化合物的报道最早来自葡萄酒[29-30]，近年在中国白酒董酒中发现较多的萜烯类[31-32]。金银花酒中存在多种萜烯类化合物，其中芳樟醇（又名沉香醇、里那醇）对金银花酒风味贡献较大（OAV=120.3），呈浓青带甜的木青香，资料显示，芳樟醇正是金银花中发挥主要药理作用价值的物质之一[33]，其作为一种功能活性物质已被证明能够减轻肺部炎症[34]，研究曾在玫瑰香型葡萄酒中发现少量芳樟醇[35]，而在中国白酒为首次被检出、报道。β-大马酮（OAV=3 825）是金银花酒中的最重要香气物质，其香气阈值很低，沸点很高，虽然其在酒中的含量较少，但赋与了金银花酒强烈、愉快的“花香”、“甜香”。β-大马酮作为香气化合物，曾在威士忌酒、朗姆酒、白兰地酒中被检出、报道[36-38]。在中国白酒中，β-大马酮首次在汾酒中发现，在其他几大香型（浓香型、酱香型、兼香型等香型）白酒中报道较少[39]。另外，罗勒烯、萜品油烯、α-柏木烯、反式丁香烯均被报道存在于水仙花[40]、香雪兰[41]以及柑橘类果皮[42]等植物中，由此推测萜烯类化合物也是金银花酒中金银花香气贡献的关键物质。

除了以上化合物，烃类化合物也占了相当大的比例，其比例与酯类相当。推测其可能与金银花木质微生物发酵的代谢产物有关，由于酿造花酒的原料中有糖，含碳量高，经小曲糖化发酵后碳原子形成饱和链烃。目前，在其他类型的白酒中鲜见到如此数量多的烷烃类化合物报道。从化合物质量浓度上来看，最高的烃类是十六烷、十五烷、十八烯，此类物质曾在金银花挥发油中被报道[20]，这些化合物对酒体整体香气有一定贡献，课题组正在进一步开展相关的检测和验证。

2.2.2 金银花酒香气特征

图2 金银花酒整体香气轮廓分析Fig. 2 Analysis of the aroma profile of honeysuckle flower liquor

由图2可看出，整体上金银花酒的香气协调丰满，以花香和甜香为主，发酵香、果香和草本香气也占较大比例，曲香、酯香、粮香占比较小。该整体风格主要缘于其采取特制小曲作为发酵剂，采用相似于清香型小曲白酒的酿造工艺，兼有小曲酒风味；同时，采用纯金银花作为酿酒原料，而未加粮食，自然粮香味低，而金银花的原料风味较突出。在金银花酒中OAV最高的是β-大马酮（玫瑰芳香，糖果甜香），其次是辛酸乙酯（似白兰地，甜香）、乙缩醛（青草香，果香）、3-甲基丁酸乙酯（果香，酯香）、芳樟醇（浓青带甜的木青香气）、苯乙醇（青草香，玫瑰花香，蔷薇香气，花粉味）、癸酸乙酯（果香和酒香香气）、乙酸异戊酯（愉快的蕉香）、月桂酸乙酯（花果香，果香）、己酸乙酯（菠萝香气）、乙醛（甜味，果香）、罗勒烯（草香，花香，橙花油香）、辛酸异戊酯（水果香，似白兰地酒香）、2-甲基丁醇（葡萄酒香，醇香）、反式丁香烯（丁香花香）这些化合物为金银花酒特有香气成分，对酒体风格具有重要贡献，其部分已被确定为清香型酒的重要香味成分[25-26,36-37]。

2.3 活性功能成分分析

从表3可知，金银花酒中含有咖啡酸、芦丁、绿原酸、木犀草苷、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、隐绿原酸、槲皮素等活性功能成分。

据报道金银花所含化学成分有绿原酸、异绿原酸、黄酮化合物、芳樟醇和双花醇等[2-3]。主要有效成分有挥发油：具有抑菌抗病毒作用；木犀草素：具有抗菌、消炎、改善心血管功能及解痉、祛痰、抗癌作用；酚酸类物质：绿原酸、异绿原酸具有广谱抗菌及抗氧化的作用。

表3 金银花固态发酵酒活性功能成分检测分析Table 3 Bioactive components in honeysuckle flower liquor

由表3可知，本研究样品金银花酒中含有大量绿原酸，质量浓度达到40.49 mg/L，异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、隐绿原酸、新绿原酸也有相对较高的含量。木犀草苷和芦丁作为黄酮类主要成分的代表，是金银花酒中重要的微量功能活性成分。金银花酒中有如此多的活性功能成分，是因利用鲜花直接固态发酵，提高了酒的品质和原料中有效活性功能成分的利用率，使金银花中的营养成分和药理保健成分及其风味等得到保留和转移到酒体中。此类活性成分在其他种类白酒中极少，甚至鲜见报道，为金银花纯花固态发酵酿造白酒的酒体差异性、显著性特征。

3 结 论

本研究花酒主要原材料来源于植物花卉，取代了常规花酒中的粮食成分，从原料上杜绝了甲醇的产生，酿制过程中不添加任何添加剂、色素和粮食，陶坛纯花固态发酵。通过调节、控制发酵工艺参数，实现本地资源原料发酵、微生物代谢，富集乙醇及酒体中的风味化合物和活性功能成分，再通过蒸馏，获取金银花基酒，基酒经过坛藏足年贮存，勾兑成成品酒，使金银花中的营养成分和活性功能成分和花的风味等完全得到保留、利用。酒体的口感风味具有金银花的花香、芳香、绵甜等特点，产品淡韵留香、清爽甘冽，酒水层次丰满，口感绵甜柔和，后味爽净悠长，花香独特。该酿造技术已经获得国家发明专利，走在行业前沿。

固态纯化发酵金银花酒中重要的香气化合物有β-大马酮、辛酸乙酯、乙缩醛、3-甲基丁酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇、癸酸乙酯、乙酸异戊酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯、乙醛、罗勒烯、辛酸异戊酯、2-甲基丁醇、反式丁香烯，其风味与清香型白酒有一定相似性，同时具有金银花的花香风味特征。整体香气轮廓图表明，其香气协调丰满，以花香和甜香为主。金银花酒中含有很高的绿原酸及黄酮类物质含量，有一定的保健功效。检测结果表明金银花酒中不含甲醇等酒类产品监管安全因子。酒体感官呈现金银花的花香特征香气，本研究虽然分析检测金银花酒中呈花香的化合物，但仍然未准确定性出金银花的特征香气成分，需进一步探究。