13 种河豚鱼CO I基因部分DNA序列分析及在物种鉴定中的应用

陈文炳，缪婷玉，翁国柱，陈融斌，邵碧英，彭 娟，江树勋

（1.福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，福建 福州 350001；2.莆田出入境检验检疫局，福建 莆田 351100；3.集美大学水产学院，福建 厦门 361021）

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增技术在食品动物成分鉴别中已得到广泛应用[1-4]，早期DNA条形码是指通过PCR扩增与测序获得的长度适当的线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I，CO I）基因的DNA片段[5]，其间碱基序列在物种间遗传变异较大，而在种内遗传变异小，相对稳定。近年来，被作为DNA条形码的不仅限于CO I基因，包括基于16S rRNA和线粒体细胞色素b（cytochrome b，Cyt b）基因的DNA条形码，都已被广泛应用于鱼类物种鉴别[6-18]。在河豚鱼物种分化分子生物学研究领域，陈超等[19]应用随机扩增多态性DNA（random amplification of polymorphic DNA，RAPD）标记技术对4种东方鲀属河豚鱼进行系统关系的研究分析。邵爱华等[20-24]以暗纹东方鲀（Takifugu fasciatus）为研究材料，对16S rRNA基因、Cyt b基因及CO I、CO II、CO III 3 种亚基等进行了一系列的序列分析研究。本课题组前期建立并优化了河豚鱼物种成分的PCR检测方法[25]，以及对河豚鱼的Cyt b与16S rRNA的靶基因序列进行同源性分析[26-27]，探讨物种间的亲缘关系，并对基于芯片生物分析系统[28]与限制性内切酶确证河豚鱼物种成分PCR检测结果等进行了一系列探讨[29]。

本实验利用13 个已知物种名称的河豚鱼CO I基因靶序列进行序列同源性比对分析，建立样品间的系统关系树，并将9 个未知种名的河豚鱼样品与13 个已知物种名称的CO I基因靶序列进行同源性比对分析，为基于CO I基因的DNA条形码技术在河豚鱼物种鉴定中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

表1 22 个河豚鱼供试样品Table 1 Twenty two samples of puffer fishes tested in this study

已知物种名称的河豚鱼样品11 个来自福建莆田、厦门等水产养殖场，2 个来自福建省集美大学水产学院近海捕捞；5 个未知物种河豚鱼干样品来自福建福州沿海，4 个未知物种新鲜个体来自海南省（表1）。

十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB） 上海博亚生物技术有限公司；2×Taq PCR Master Mix、蛋白酶K、DNA Marker I 天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖 英国Oxoid公司；CO I基因PCR扩增通用引物根据文献[30]进行序列修改，正向CO I A：5’-GGCGTATGCGTCTGGGTAGTC-3’，反向CO I F：5’-CCTGCAGGAGGAGGAGATCC-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 仪器与设备

Ultrospec 1100 pro核酸蛋白分析仪 瑞典Amersham公司；T-Gradient梯度PCR仪 德国Biometra公司；Power Pac 1000电泳仪 美国Bio-Rad公司； GL212 PRO凝胶成像仪 美国Carestream公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取与PCR扩增

DNA提取方法与PCR扩增参照文献[25]。取鲜肉或干样50 mg加入CTAB裂解液后在超声波环境中65 ℃温育处理30 min，进行DNA提取、PCR产物电泳，并拍照保存。

1.3.2 DNA碱基序列测定、比对、同源性分析

PCR扩增产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，DNA序列用DNAMAN V6分析软件进行整理分析，以.seq格式输出，并对各个样品的DNA序列进行比对与同源性分析，比对结果以MASED Document/DNAMAN1格式输出。

2 结果与分析

2.1 CO I基因序列分析与比对

表2 河豚鱼的CO I基因PCR产物碱基序列的基本信息Table 2 Information about partial sequences of the CO I gene from puffer fish

对CO I基因PCR扩增引物进行扩增，获得的PCR产物进行测序，片段大小为681 bp，碱基序列基本信息与基因库（GenBank）登录号见表2。碱基序列同源性分析结果表明，13 个已知种名的河豚鱼样品碱基序列差别主要表现在单个碱基的置换。

2.2 序列同源性分析

图1 13 个已知种名河豚鱼的CO I部分基因PCR产物碱基序列同源树Fig. 1 Phylogenetic tree based on CO I sequence homology among 13 known species

13 个已知种名的河豚鱼样品间同源率为84%～100%（图1），可归为4组，第I组含兔头鲀属的黑腮兔头鲀与兔头鲀2个种及虫纹东方鲀，同源率为100%；第II组月腹刺鲀，与第I组同源率87%，第III组含腹刺鲀属的棕斑腹刺鲀、暗鳍腹刺鲀2 个种，同源率为90%，与I组、II组间同源率86%，第IV组含东方鲀属的7个种，同源率在95%～100%之间。CO I部分基因PCR产物碱基序列同源性分析结果，除虫纹东方鲀归到兔头鲀属外，其他物种划分与形态学物种分类较为吻合，但是，物种间同源率达到100%，不利于作为物种鉴别的指标，因此有必要通过其他基因作为辅助组合，加以判断。

2.3 未知种名河豚鱼样品的种属

CO I基因部分片段的PCR产物序列同源性聚类分析结果显示（图2），包括9 个未知种名的样品，22 个供试样品可分为4 个组，其中9 个未知种名的样品被归类到3 个类群组中，分别属于东方鲀属和腹刺鲀属2 个属。无未知种名样品归到I组；HNW2归到II组，与月腹刺鲀同源率100%；HNW3、HNW4、FJW2、FJW5、HNW1共5个样品归到第III组（腹刺鲀属），其中HNW3、HNW4、FJW2、FJW5与棕斑腹刺鲀同源率为100%，HNW1与暗鳍腹刺鲀同源率100%；FJW1、FJW3、FJW4 3个样品归到第IV组，与横纹东方鲀同源率均为100%。

根据上述分析结果判定，9 个未知种名的样品中，1 个样品（HNW2）为月腹刺鲀，4 个样品（HNW3、HNW4、FJW2、FJW5）为棕斑腹刺鲀，1 个样品（HNW1）为暗鳍腹刺鲀，3 个样品（FJW1、FJW3、FJW4）为横纹东方鲀。该结果与笔者基于同样河豚鱼13 个样品的Cyt b基因部分序列（使用的XBssb引物[31]：正向：5’-GGCGTGAAAAACCATCGTTG-3’，反向：5’-CCCCGACATTCGGTTTACAAGAC-3’）聚类分析结果（未发表）高度吻合（图3），图3中除FJW2样品与棕斑腹刺鲀同源率为96%以外，其他8个样品归类结果与本实验聚类分析结果（图2）完全一致。

图2 已知种名与未知种名河豚鱼的CO I部分基因PCR产物碱基序列同源树Fig. 2 Phylogenetic tree based on CO I sequence homology between known and unknown species

图3 13 个已知种名与9 个未知种名的河豚鱼样品Cyt b（XBssb引物）部分基因PCR产物序列同源树Fig. 3 Phylogenetic tree based on Cyt b sequence (using XBssb primers)homology between known and unknown species

3 结论与讨论

本实验获得的3 属13 种河豚鱼样品的CO I基因部分片段DNA碱基序列共13 条，提交GenBank，取得相应的登录号（表2）。探讨了CO I基因部分序列的DNA条形码技术在河豚鱼种属鉴别中应用的可能性。根据DNA条形码序列聚类分析，判定了9 个未知种名的河豚鱼样品所属的物种，其中，HNW2为月腹刺鲀，HNW3、HNW4、FJW2、FJW5均为棕斑腹刺鲀，HNW1为暗鳍腹刺鲀，FJW1、FJW3、FJW4为横纹东方鲀。该结果在XBssb引物[23]对同样河豚鱼样品的Cyt b基因部分序列进行PCR扩增获得的序列聚类分析结果（图3）中得到验证。另外，本实验对已知种属的样品分类与未知样品的种属判定结果也比笔者之前基于另一个Cyt b基因片段部分DNA序列[26]及16S rRNA基因部分DNA序列的分类结果[27]更接近形态学分类、更合理。可见本实验选择的CO I基因的DNA片段序列是比较理想的河豚鱼物种归类的鉴定指标，可以用于河豚鱼种属鉴定。13号样品虫纹东方鲀在16S rRNA[27]、Cyt b基因（图3）及本研究CO I基因的DNA片段序列的同源性聚类分析结果，都是与兔头鲀属归为一组，且同源率达99%～100%，可能形态学分类上存在误差，此问题有待进一步探讨。